閻國(guó)強(qiáng) 劉莉莉 梁 震 任 娟 舒 雄 趙丹慧

(1.北京積水潭醫(yī)院/北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京 100035)(2.北京積水潭醫(yī)院針灸科，北京 100035)(3.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心，北京 100088)

兒童肥胖已經(jīng)成為日益嚴(yán)峻的健康問(wèn)題[1]，不僅是影響體質(zhì)量，還影響到包括骨骼在內(nèi)的多個(gè)器官和系統(tǒng)[2-4]。然而，肥胖對(duì)不同性別兒童骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨質(zhì)量的影響還沒(méi)有深入的研究。由于人類肥胖的原因大多是由能量攝入過(guò)多導(dǎo)致脂肪堆積，所以高脂飼料飼喂是最常用的建模方式。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)生長(zhǎng)期SD大鼠的方法建立兒童肥胖模型，并探討高脂飲食對(duì)雌、雄生長(zhǎng)期大鼠體質(zhì)量和骨質(zhì)量的影響，并對(duì)差異性進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只SPF級(jí)21日齡 SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量50～60 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010，飼養(yǎng)于北京積水潭醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF屏障設(shè)施內(nèi)的IVC籠盒內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0035。室溫：23～27 ℃，相對(duì)濕度：(55±5)%，24 h恒溫恒濕。12 h/12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，3只/籠盒。本實(shí)驗(yàn)遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，并經(jīng)北京積水潭醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，積倫動(dòng)審字第201909-01。

1.2 飼料配方

1.2.1SPF級(jí)繁殖鼠料(g)：豬油(2.00)、酪蛋白(20.00)、玉米淀粉(26.00)、麥芽糊精(3.50)、蔗糖(35.00)、纖維素(5.00)、豆油(2.50)、檸檬酸鉀(1.65)、磷酸鈣(1.68)、碳酸鈣(0.71)、無(wú)機(jī)鹽(1.00)、維生素(1.00)以及胱氨酸(0.30)。其中鈣含量(%)：1.10；磷含量(%)：0.60。

1.2.2SPF級(jí)60%脂供能高脂飼料(g)：豬油(31.66)、酪蛋白(25.84)、麥芽糊精(17.15)、蔗糖(8.85)、纖維素(6.46)、豆油(3.23)、檸檬酸鉀(1.20)、磷酸鈣(1.68)、碳酸鈣(0.71)、無(wú)機(jī)鹽(1.29)、維生素(1.29)以及胱氨酸(0.38)。其中鈣含量(%)：1.10和磷含量(%)：0.60。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(上海通善生物科技有限公司)；多聚甲醛(廣州賽國(guó)生物科技有限公司)；Micro-CT(型號(hào)：Skyscan 1172，Brucker MicroCT)，電子天平(型號(hào)YHC-11001 A，瑞安市英衡電器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物分組：24只大鼠隨機(jī)分為普食組和高脂組，n=12,各組雌雄各半。實(shí)驗(yàn)大鼠分別給予SPF繁殖飼料和60%脂供能高脂飼料喂養(yǎng)6周后，使用過(guò)量的3%戊巴比妥鈉6 mL/kg腹腔注射安樂(lè)死取材。

1.4.2體質(zhì)量檢測(cè)：使用電子秤測(cè)量大鼠的體質(zhì)量，每只大鼠測(cè)量?jī)纱?，結(jié)果取兩次測(cè)量數(shù)值的平均值。

1.4.3骨質(zhì)量檢測(cè)：微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro Computed Tomography，Micro-CT)，是一種非破壞性的三維成像技術(shù)，可以在不破壞樣本的情況下，清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)[5]。使用Micro-CT對(duì)大鼠右側(cè)股骨進(jìn)行掃描，掃描范圍是股骨遠(yuǎn)端1/3部分，掃描參數(shù)為：電壓45 kv；電流165 μA；曝光時(shí)間500 ms；旋轉(zhuǎn)角度180°；旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)是0.4°；過(guò)濾器采用0.5 mm AL；掃描分辨率是8 μm。掃描完畢后使用系統(tǒng)自帶軟件(CTan，V1.14.4)對(duì)掃描圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和三維重建。掃描區(qū)域?yàn)楣晒沁h(yuǎn)端生長(zhǎng)板上方100～400層，厚度為2.4 mm的松質(zhì)骨。檢測(cè)指標(biāo)包括骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨表面積骨體積比(BS/TV)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨表面積體積比(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

21日齡大鼠，兩組比較，在雌性和雄性體質(zhì)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。6周后大鼠的體質(zhì)量均明顯增加，與普食組比較，高脂組大鼠體質(zhì)量明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且雄性大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)速度更快，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后大鼠體質(zhì)量的比較(g)

2.2 高脂飲食對(duì)大鼠BMD的影響

飼養(yǎng)6周后，與普食組相比，高脂組大鼠BMD均明顯降低，但僅雌性大鼠BMD下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 高脂飲食對(duì)大鼠BMD的影響(g/cm)

2.3 高脂飲食對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

飼養(yǎng)6周后，與普食組相比，高脂組大鼠BV/TV，BS/TV和Tb.Sp出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)，而B(niǎo)S/BV和Tb.Th變化不明顯(P>0.05)，見(jiàn)表3和圖1。

表3 高脂飲食對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁三維重建圖

3 討論

人類肥胖的主要原因與能量攝入過(guò)多導(dǎo)致脂肪堆積有關(guān)，所以實(shí)驗(yàn)常采用高脂飼料誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠來(lái)研究肥胖的機(jī)制及肥胖引起的相關(guān)疾病[6-7]。大鼠在不同的生長(zhǎng)階段體質(zhì)量增加的內(nèi)容不同，幼年期主要以肌肉和骨骼為主，成年期主要以脂肪增加為主。目前，對(duì)于肥胖動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚不完全統(tǒng)一，如徐云鵬等[8]報(bào)道，根據(jù)大鼠體質(zhì)量和 Lee’s 指數(shù)評(píng)估大鼠肥胖程度，篩選高脂組大鼠，將體質(zhì)量和 Lee’s指數(shù)高于正常對(duì)照組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異者認(rèn)定為肥胖模型。除此之外，也有實(shí)驗(yàn)超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量10%～15%作為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)造模是Yang等[9]超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量20%視為建模成功。本研究采用21日齡 SD大鼠高脂飲食誘導(dǎo)6周，高脂組大鼠體質(zhì)量均超過(guò)普食組大鼠平均體質(zhì)量10%，其中雌鼠和雄鼠的增長(zhǎng)分別是11%和18.9%，證明肥胖大鼠模型建立基本成功，但未能達(dá)到理想值20%，原因可能是造模過(guò)程中存在肥胖抵抗的個(gè)體所致。SD大鼠的肥胖呈中心性肥胖，造模符合飲食誘導(dǎo)的腹心性肥胖[10]，適合研究長(zhǎng)期高脂飲食造成的肥胖對(duì)骨代謝的影響。

根據(jù)Liab等[11]報(bào)道，在骨量指標(biāo)中， BMD是最能代表骨含量的參數(shù)。實(shí)驗(yàn)飼喂6周后，雌性大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，而雄性大鼠的BMD雖降低，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此說(shuō)明幼年雌性大鼠在高脂飼料誘導(dǎo)下更容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，這與Zhao等[12]臨床研究發(fā)現(xiàn)的肥胖女童BMD和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)之間存在關(guān)聯(lián)的結(jié)果具有一致性，主要原因可能與雌性大鼠BMD開(kāi)始上升及達(dá)到峰值的時(shí)間較早于雄性大鼠有關(guān)。

BV/TV為松質(zhì)骨骨量評(píng)價(jià)常用指標(biāo)，對(duì)于髓腔內(nèi)松質(zhì)骨而言，該比值能夠反應(yīng)不同樣本骨小梁骨量的多少。BS/TV可以間接反映骨量多少。在骨微結(jié)構(gòu)中，Tb.Sp為骨小梁之間的髓腔寬度，其增加提示骨吸收增加，可能發(fā)生骨質(zhì)疏松[13]。造模后，與普食組相比，高脂組BV/TV、BS/TV及 Tb.Sp均顯著降低，說(shuō)明雌性和雄性大鼠的骨量都明顯丟失。

BS/BV能夠間接反應(yīng)骨代謝狀況，該值升高說(shuō)明骨合成代謝大于分解代謝，骨量增加，反之亦然。造模后，與普食組相比,高脂組BS/TV和Tb.Th無(wú)顯著性差異，可能是由于未成年大鼠的骨活性或成骨能力未發(fā)生明顯變化，只是出現(xiàn)了骨量的整體性缺失。高脂飲食對(duì)骨骼系統(tǒng)的影響并不是單一方向的，而是存在正向和負(fù)向的雙重作用。一方面, 隨體質(zhì)量上升的脂肪和肌肉的質(zhì)量對(duì)骨骼施加的機(jī)械負(fù)荷增加, 進(jìn)而刺激骨轉(zhuǎn)換, 促進(jìn)骨量的積累; 另一方面, 脂肪過(guò)度積累帶來(lái)能量代謝異常, 將改變體內(nèi)激素水平及增加促炎性因子, 可引起骨代謝紊亂和骨量丟失[14-15]。

綜上所述，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)的生長(zhǎng)期SD大鼠可造成部分大鼠肥胖，其中雄性大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度更快，更適合做肥胖模型動(dòng)物。高脂飲食能夠誘導(dǎo)生長(zhǎng)期大鼠出現(xiàn)成骨能力未降低的骨質(zhì)疏松，形成骨量整體性缺失，且雌性比雄性更為顯著。根據(jù)結(jié)果進(jìn)一步推論，生長(zhǎng)期的高脂飲食可能與骨質(zhì)疏松具有一定的相關(guān)性，但本研究?jī)H從骨的微結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行了研究，今后將在更多層面就其機(jī)制的相關(guān)性進(jìn)行深入實(shí)驗(yàn)探索。