何滋林 姚敏樺 韋 濤 趙博厚 祁藝新 紀(jì)慶超 常雯雯 劉曉東 隋宏書(shū)

(山東第一醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，泰安 271000)

雪貂(Mustelaputoriusfuro)，哺乳綱食肉目鼬科貂屬。成年雪貂平均體質(zhì)量0.5～2.7 kg，平均體長(zhǎng)33～41 cm，平均尾長(zhǎng)7.6～10 cm，壽命為7～10歲。雪貂屬夜食性動(dòng)物，性情溫和、行動(dòng)敏捷且好奇心強(qiáng)。其消化系統(tǒng)短且缺乏盲腸，因此機(jī)體代謝快。

在普通條件下，雪貂生理狀況易受多種因素影響，容易患病。因此，建立一套科學(xué)的、可行的且規(guī)范的飼養(yǎng)方法非常重要。結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定和本實(shí)驗(yàn)室雪貂飼養(yǎng)管理的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出一套規(guī)范、實(shí)用及可行性高的操作程序。

1 生活環(huán)境

1.1 居住環(huán)境

根據(jù)王寧等[1]報(bào)道，動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室與生活區(qū)的距離應(yīng)符合《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》的要求，籠舍和設(shè)施的設(shè)計(jì)應(yīng)充分考慮為動(dòng)物提供舒適的環(huán)境和足夠的空間。籠-盆結(jié)合籠舍，籠和盆采用不銹鋼和聚乙烯材料，材料無(wú)毒、硬度大且耐磨性強(qiáng)；籠網(wǎng)格間距3 cm且網(wǎng)絲直徑2 mm，防止小雪貂逃逸?；\舍較大的空間滿足了雪貂愛(ài)群居和活潑好動(dòng)的需要；塑料底盤(pán)內(nèi)盛有由優(yōu)質(zhì)木屑和散砂按5∶1配成的墊料。墊料應(yīng)該保證清潔、干燥、吸水、無(wú)蟲(chóng)以及毒害物質(zhì)不能超標(biāo)，不能含有殺蟲(chóng)劑和殺菌劑。分層飼養(yǎng)既能節(jié)約飼養(yǎng)面積，又利于通風(fēng)。在分娩期，雪貂籠內(nèi)放置內(nèi)置產(chǎn)籠可以提高雪貂分娩成功率，同時(shí)也為幼崽提供安全舒適的環(huán)境。

1.2 外周環(huán)境

根據(jù)王寧等[1]報(bào)道，雪貂生活的適宜溫度是22～24 ℃，相對(duì)濕度是40%～60%，雪貂缺少汗腺，當(dāng)溫度超過(guò)32 ℃，成年貂會(huì)焦躁、緊張不安，甚至出現(xiàn)熱虛脫的癥狀。雪貂主要通過(guò)呼吸系統(tǒng)散熱，所以要注意控制飼養(yǎng)間溫度。雪貂的呼吸道對(duì)異物敏感，過(guò)多的灰塵會(huì)刺激雪貂氣道，飼養(yǎng)間要定期進(jìn)行除塵操作?？照{(diào)處理比較簡(jiǎn)單，按一般舒適性的空調(diào)系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)，包括進(jìn)風(fēng)和除塵裝置、消毒設(shè)備以及處理室內(nèi)溫度和相對(duì)濕度的設(shè)備。

2 飼養(yǎng)方式

飲用水要求：(1)煮沸消毒滅菌，無(wú)需蒸餾、離子交換和反滲透，以滿足動(dòng)物對(duì)微量元素的需求；(2)溫度保持30 ℃左右，防止水溫過(guò)高或過(guò)低刺激雪貂消化道；(3)隨時(shí)注意水質(zhì)變化，定期對(duì)水壺進(jìn)行消毒處理，防止細(xì)菌滋生，消毒周期一般為3 d[ 1 ]。飲水裝置：動(dòng)物專(zhuān)用滾珠水壺。

雪貂對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較高，飼喂市場(chǎng)上銷(xiāo)售的雪貂顆粒料，會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良，生長(zhǎng)緩慢，分娩后的母貂甚至出現(xiàn)食仔的應(yīng)激反應(yīng)。根據(jù)馬建章等[2]報(bào)道，雪貂生長(zhǎng)發(fā)育情況見(jiàn)表1所列，3月齡內(nèi)的雪貂使用羊奶喂養(yǎng)；4月齡內(nèi)雪貂生長(zhǎng)旺盛，應(yīng)該選用高蛋白質(zhì)及高脂肪的飼料；4月齡后生長(zhǎng)放緩，使用高蛋白質(zhì)及高脂肪的飼料，雪貂會(huì)出現(xiàn)溢脂(貂毛變黃、脫毛，首先出現(xiàn)“老鼠尾”)。因此，改進(jìn)飼料：將熟雞肉和貂哺乳期膨化混合飼料(愛(ài)得利都牌，主要成分見(jiàn)表2所列)使用攪拌機(jī)充分混勻，制成不同生長(zhǎng)階段的肉粒狀飼料，為充分符合雪貂的肉食特性，投喂時(shí)適當(dāng)添加羊奶，同時(shí)以雪貂顆粒料作為輔食。飼料保證蛋白質(zhì)不低于38%，脂肪不低于18%。

表1 雪貂生長(zhǎng)發(fā)育情況[2]

表2 愛(ài)得利都貂哺乳期用膨化混合飼料產(chǎn)品主要成分(%)

表3 不同生長(zhǎng)階段雪貂飼料配方

3 雪貂的實(shí)驗(yàn)操作

3.1 抓取保定

雪貂牙齒鋒利會(huì)帶來(lái)危險(xiǎn)，抓取時(shí)必須佩戴防護(hù)手套。單手抓住雪貂的頸背部，將其四肢懸空進(jìn)行固定，大多數(shù)雪貂在這種姿勢(shì)下比較放松和配合，可以進(jìn)行皮下或腹腔藥物注射(圖1)。

圖1 雪貂抓取

3.2 雪貂體溫及體質(zhì)量的測(cè)量

由于體溫及體質(zhì)量變化是構(gòu)建流感病毒模型后，病程進(jìn)展變化的重要指標(biāo)，因此，除了需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行測(cè)量外，也需要在每天的同一時(shí)刻進(jìn)行測(cè)量以排除動(dòng)物體溫和體質(zhì)量在1 d內(nèi)的波動(dòng)。體溫測(cè)量時(shí)，將甘油潤(rùn)滑后的電子體溫計(jì)插入雪貂直腸，保持體溫計(jì)讀數(shù)5～10 s無(wú)變化后進(jìn)行記錄。雪貂的正常體溫范圍是37.8～40 ℃，平均體溫是38.8 ℃，電子體溫計(jì)檢測(cè)操作簡(jiǎn)便快捷、數(shù)值穩(wěn)定且記錄準(zhǔn)確，對(duì)雪貂無(wú)影響。測(cè)量體質(zhì)量時(shí)，將雪貂從籠具內(nèi)取出放于電子秤上保持讀數(shù)靜止3 s以上再進(jìn)行記錄，精確度0.01 kg。

3.3 雪貂麻醉

根據(jù)張濤等[3]報(bào)道，麻醉劑的配方和用量見(jiàn)表4所列，使用配制的麻醉劑為舒泰50和速眠新Ⅱ。將舒泰50和速眠新Ⅱ按照1∶5的體積比充分混合，每只雪貂使用劑量為0.05～0.08 mL/kg。按照上述方式抓取雪貂使其仰臥，使用75%乙醇棉球在雪貂大腿內(nèi)側(cè)消毒，將麻醉劑注入其大腿肌肉組織中。每只雪貂注射0.08 mL麻醉劑后，觀察雪貂眼睛及四肢的松弛狀態(tài)和程度來(lái)確定是否完全麻醉。研究統(tǒng)計(jì)顯示,雪貂在該劑量下維持麻醉時(shí)間為45～90 min，該劑量能保證對(duì)雪貂有效的麻醉，同時(shí)不會(huì)過(guò)度麻醉導(dǎo)致雪貂長(zhǎng)時(shí)間不能蘇醒。淺麻醉用在流感病毒經(jīng)鼻造模，因?yàn)檠醣旧淼膰娞绶瓷鋾?huì)影響造模的成功率；雪貂采血或處死時(shí)，需要深層麻醉，采取注射麻醉方法，保證對(duì)雪貂操作有足夠時(shí)間，同時(shí)嚴(yán)格控制麻醉劑的用量，降低過(guò)度麻醉給雪貂和實(shí)驗(yàn)造成的影響。另外，麻醉劑需要專(zhuān)人負(fù)責(zé)管理，提前配制好足量的麻醉劑。由于存在個(gè)體差異，同質(zhì)量雪貂會(huì)出現(xiàn)耐受性情況，可適當(dāng)補(bǔ)充注射麻醉劑。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)山東省第一醫(yī)科大學(xué)福利倫理審查，編號(hào)：山東省醫(yī)動(dòng)批：NO.2021-662。

表4 麻醉配方和用量[3]

3.4 雪貂心臟采血和分離血清

Matsuoka等[4]實(shí)際操作顯示，雪貂前腔靜脈血管較細(xì)，頸部皮膚較疏松，針頭容易滑落，所以采用易操作且成功率較高的心臟采血，且一次采血不能超過(guò)10%的動(dòng)物血液量。將雪貂按上述方式抓取和麻醉，仰臥平放在生物安全柜內(nèi)的操作盤(pán)中，使用剃毛器將雪貂胸前的體毛剪掉，用手探明心臟搏動(dòng)最強(qiáng)部位，通常在胸骨左緣的正中，位于倒數(shù)第2～3肋骨中間。采血部位用75%乙醇擦拭消毒，使用1 mL一次性注射器垂直緩慢刺入心臟，緩慢拔針抽血，直到血開(kāi)始填充注射器，收集所需血量后，拔出針頭，使用消毒脫脂棉輕壓注射部位止血。將血液轉(zhuǎn)移到血清分離管，室溫靜置25 min以上，12 000 r/min離心10 min，將分離血清轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中，-20 ℃保存。研究顯示雪貂每周一次心臟采血0.5～0.6 mL，連續(xù)采血不超過(guò)兩個(gè)月，對(duì)雪貂健康狀況和體征指標(biāo)無(wú)明顯影響。

3.5 雪貂處死和組織取樣

雪貂在組織取樣及剖檢前需要執(zhí)行安樂(lè)死。使用0.4 mL麻醉藥注射雪貂大腿肌肉，使其在1～2 min深度麻醉，可以通過(guò)心臟穿刺采集大量血液(50 mL左右)，然后心臟穿刺注射安樂(lè)死 Euthanasia Ⅲ 溶液(每毫升包含50 mg苯妥英鈉和390 mg戊巴比妥鈉)[4]。正確收集雪貂的組織樣本對(duì)于分析非常重要，需使用單獨(dú)的器械收集不同組織樣品，將要收集的組織所需要器具放在用75%乙醇消毒的燒杯中，每個(gè)組織單獨(dú)放入一個(gè)燒杯。用無(wú)菌紗布輕拭擦凈，將采集的組織放入預(yù)先稱(chēng)質(zhì)量和標(biāo)記清晰的收集管內(nèi)盡快凍存。根據(jù)Matsuoka等[4]報(bào)道，理論上，雪貂組織應(yīng)優(yōu)先收集病毒含量低的組織，如腦、心、肝、脾及腎組織，使高病毒含量器官(如肺)造成的污染降低到最小。

3.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)束廢棄物和動(dòng)物的處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下，應(yīng)選擇“仁慈終點(diǎn)”，避免動(dòng)物延長(zhǎng)承受痛苦的時(shí)間[1]。實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的固體廢棄物主要包括實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的儀器、一次性器具、動(dòng)物尸體、組織等。對(duì)于價(jià)值較高可以重復(fù)使用的儀器(如剪刀、解剖刀等)，使用高壓蒸汽滅菌法或微波消毒法進(jìn)行滅菌消毒，這兩種方法具有穩(wěn)定可靠的滅菌作用[5]。一次性器具用后必須毀型和無(wú)害化處理，嚴(yán)禁重復(fù)使用[6]。動(dòng)物尸體和組織切片裝入專(zhuān)用醫(yī)療垃圾袋中，仔細(xì)消毒后放入冷柜中貯存，轉(zhuǎn)交專(zhuān)業(yè)公司進(jìn)行無(wú)害化處理[5]。

4 小結(jié)與展望

建立一套科學(xué)、可行且規(guī)范的雪貂飼養(yǎng)管理方法，對(duì)從事實(shí)驗(yàn)雪貂相關(guān)的科研有重要的指導(dǎo)作用和現(xiàn)實(shí)意義。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)雪貂時(shí)，應(yīng)合理控制雪貂飼養(yǎng)間的溫度、相對(duì)濕度、噪聲、空氣質(zhì)量等環(huán)境因素，提供較大的飼養(yǎng)空間，科學(xué)控制飼料及飲水。下一步，將繼續(xù)嘗試研究一種科學(xué)管理孕期雪貂的方法，以降低雪貂流產(chǎn)率。