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      微塑料聚乙烯、聚氯乙烯對(duì)大型蚤的毒性作用研究

      2021-12-04 21:29:55?;哿?/span>宋怡彤
      科技信息·學(xué)術(shù)版 2021年30期

      ?;哿?宋怡彤

      摘要:本實(shí)驗(yàn)以大型蚤為模式生物,探討兩種微塑料對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)、繁殖及營(yíng)養(yǎng)狀況等毒性效應(yīng)。結(jié)果表明,5 μm粒徑的PE和PVC對(duì)大型的LC50-96h值分別為199.99 mg·L-1和48.19 mg·L-1,兩種微塑料暴露21 d后,PE和PVC顯著抑制大型蚤的脫皮數(shù)和心率以及降低大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量.

      關(guān)鍵詞:微塑料,PE,PVC,毒性效應(yīng)

      Study on the Toxicity of Polyethylene and Polyvinyl Chloride to Daphnia magna in microplastics

      Zhu Huiling,Song Yitong

      Department of biology and environmental engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou,310015,China

      Abstract:In this experiment,Daphnia magna was used as a model organism to investigate the toxic effects of two microplastics on the growth,reproduction and nutritional status of Daphnia magna.The results showed that the LC50–96 h values of PE and PVC with 5μm particle size for Daphnia magna were 199.99 mg·L-1and 48.19 ?mg·L-1,respectively.After exposure to two microplastics for 21 days,PE and PVC significantly inhibited the desquamation number and heart rate of Daphnia magna and reduced the content of protein in Daphnia magna.Keywords:microplastics,PE,PVC,toxic effects,mechanism

      1.引言

      微塑料(MPs)是指直徑小于5 mm的塑料碎屑和顆粒,其作為一種新興環(huán)境污染物已引起了全球研究學(xué)者和公眾的廣泛關(guān)注。目前的研究證明,微塑料廣泛存在于全球海洋、地表水、土壤、沉積物和空氣等環(huán)境介質(zhì)中,微塑料的來(lái)源、分布、毒理效應(yīng)、生態(tài)及健康風(fēng)險(xiǎn)已成為研究熱點(diǎn)[1]。水環(huán)境中最常檢測(cè)到的微塑料主要包括聚乙烯(PE)、聚氯乙稀(PVC)、聚丙?。≒P)、聚苯乙烯(PS)等。其中PE是乙烯經(jīng)聚合制得的一種熱塑性樹(shù)脂,主要用于身體、面部磨砂膏等個(gè)人護(hù)理用品和食品包裝膜、水瓶等;PVC是氯乙烯單體在過(guò)氧化物、偶氮化合物等引發(fā)劑或在光、熱作用下按自由基聚合反應(yīng)機(jī)理聚合而成的聚合物,主要用于排水管、電線、電纜、插銷(xiāo)、汽車(chē)材料、醫(yī)療器械等。我國(guó)是PE、PVC的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó),2019年的消費(fèi)量分別達(dá)到3383萬(wàn)噸和2027萬(wàn)噸[2]。微塑料在水環(huán)境中漂浮、沉積和轉(zhuǎn)移,不可避免地與浮游生物發(fā)生接觸,了解微塑料對(duì)浮游生物的影響是評(píng)價(jià)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要依據(jù)。對(duì)于水生植物而言,微塑料的存在會(huì)降低下層水體的透明度,從而抑制其光合作用;而對(duì)于水生動(dòng)物,當(dāng)微塑料尺度小于動(dòng)物攝食口器的大小時(shí)則可以直接進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi),通過(guò)食物鏈在營(yíng)養(yǎng)級(jí)之間轉(zhuǎn)移,危害大型水生動(dòng)物和整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)。此外,微塑料還可能吸附環(huán)境中的其他污染物而構(gòu)成復(fù)合污染[3]。枝角類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中的重要環(huán)節(jié),它們對(duì)毒物有很強(qiáng)的敏感性。由于大型蚤在水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中的優(yōu)越性地位,且生殖周期短、繁殖迅速、對(duì)水體中有害污染物敏感(在各種環(huán)境壓力下,表現(xiàn)出生殖力下降、活動(dòng)抑制等行為異常)等特點(diǎn),使其作為國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)生物廣泛應(yīng)用于水環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)和水生生態(tài)毒理學(xué)研究中[4]。美國(guó)環(huán)保局于1978年將大型蚤定為毒性試驗(yàn)的必測(cè)項(xiàng)目,建立了大型蚤急性毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法。1991年,我國(guó)也建立了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法[5],塑料降解過(guò)程產(chǎn)生的一系列的脅迫因子不可避免地會(huì)對(duì)大型蚤產(chǎn)生影響,研究微塑料對(duì)大型蚤的毒性對(duì)評(píng)價(jià)微塑料的生態(tài)效應(yīng)具有重要的意義[6]。

      本研究以PE和PVC為研究對(duì)象,以水環(huán)境初級(jí)消費(fèi)者大型蚤為模式生物,通過(guò)探討兩種微塑料PE和PVC對(duì)大型蚤的急性毒性致死率以及21d慢性藥物暴露對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)、繁殖及體內(nèi)蛋白質(zhì)含量等毒性效應(yīng),評(píng)價(jià)PE、PVC對(duì)水生態(tài)環(huán)境的影響及可能的健康風(fēng)險(xiǎn),為微塑料類物質(zhì)的生態(tài)危害及可能的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

      2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

      2.1實(shí)驗(yàn)材料

      2.1.1模式生物大型蚤和其食物斜生柵藻的實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)

      大型蚤(Daphnia magna)是購(gòu)自武漢科樂(lè)多生物科技有限公司大型蚤62 D.M生物株。選用OECD M4培養(yǎng)基作為大型蚤的培養(yǎng)液,培養(yǎng)條件為pH 7.8±0.2,硬度250 mg·L-1±25 mg·L-1(以CaCO3表示),Ca/Mg摩爾比接近4:1,溶解氧濃度大于2 mg·L-1。大型蚤培養(yǎng)4代后,以出生6-24 h的同批幼蚤進(jìn)行毒性試驗(yàn)。斜生柵藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所,以水生4號(hào)(HB-IV)人工培養(yǎng)液作為斜生柵藻的培養(yǎng)基。所有使用到的玻璃器皿及培養(yǎng)液均經(jīng)過(guò)HVE-50自動(dòng)高壓滅菌器121℃高溫滅菌30 min,冷卻后置于超凈工作臺(tái)內(nèi),用紫外線照射滅菌30 min,避免藻種受到其他藻類和細(xì)菌的污染。接種方法:用1000 mL三角燒瓶移取400~600 mL新鮮的水生4號(hào)培養(yǎng)基,接入藻種使之成為淡綠色。接種完成后用八層滅菌過(guò)的無(wú)紡紗布封口防止藻液受到污染,并標(biāo)上接種日期和種類,移至智能人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:光暗比12 h:12 h,光照強(qiáng)度2000 lux左右,培養(yǎng)溫度25℃左右,每天定期搖瓶5~6次防止藻種老化沉淀,以5-6天的頻率接種一次。經(jīng)常鏡檢觀察藻種是否單一(形狀上觀察)、有無(wú)其它雜菌。預(yù)培養(yǎng)3代,鏡檢細(xì)胞正常,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

      2.1.2PE和PVC測(cè)試液的配制

      低密度聚乙烯(PE)和聚氯乙烯(PVC)購(gòu)自上海陽(yáng)勵(lì)機(jī)電科技有限公司,均為5 μm優(yōu)級(jí)純微粉。試驗(yàn)所用其余試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。分散劑Tween80溶液的配置:先用移液槍取1.5μL的分散劑Tween80加入到含100mL大型蚤M4培養(yǎng)基的燒杯中,在漩渦振蕩器上震蕩30s后,超聲分散30min,即得到分散劑溶液。稱取0.04g粉末狀聚乙烯(或聚氯乙烯)顆粒于100mL分散劑溶液中,在漩渦振蕩器上震蕩1min后,超聲分散30min,得到400mg/L的聚乙烯(或聚氯乙烯)測(cè)試液。其他濃度配制方法同理。

      2.2 PE和PVC對(duì)大型蚤的急性毒性

      按照ISO標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法進(jìn)行聚乙烯和聚氯乙烯對(duì)大型蚤的急性毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)容器為潔凈的50 mL小燒杯,盛20 mL試驗(yàn)溶液,每個(gè)燒杯中放入5只剛出生6-24h的幼蚤,PE和PVC的大型蚤暴露濃度均設(shè)置為0、12.5、25、50、100、200、400 mg·L-1,水溫20~22°C,光照周期為16h光照:8h黑暗,試驗(yàn)期間不喂食,每個(gè)濃度5組平行,連續(xù)暴露96 h后,分別記錄大型蚤24、48、72、96 h的死亡情況,計(jì)算兩種微塑料對(duì)大型蚤的致死率并采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析,計(jì)算PE和PVC對(duì)大型蚤半數(shù)致死濃度LC50值。

      2.3 PE和PVC對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)繁殖等慢性毒性

      根據(jù)急性毒性試驗(yàn)求得的兩種微塑料對(duì)大型蚤L(zhǎng)C50值,慢性試驗(yàn)的PE濃度設(shè)置分別為0、12.5、25、50、100 mg·L-1;PVC濃度設(shè)置為0、3、6、12、24 mg·L-1,慢性毒性試驗(yàn)按照OECD標(biāo)準(zhǔn)方法。每個(gè)燒杯中放1只剛出生6-24h的幼蚤,每濃度設(shè)置10個(gè)平行,染毒過(guò)程中保證蚤類的生活環(huán)境適宜和食物充足,并且每天定時(shí)觀察、記錄和分離幼蚤,每3d更換一次培養(yǎng)液,其余條件與急性毒性試驗(yàn)相同。每天記錄大型蚤脫皮情況并且及時(shí)移出。試驗(yàn)21 d后統(tǒng)計(jì)兩種藥物各濃度下的脫皮數(shù),并于XD-202倒置生物顯微鏡下測(cè)定大型蚤的心率。心率的測(cè)定步驟:使用XD-202倒置生物顯微鏡對(duì)每組隨機(jī)挑選3只大型蚤進(jìn)行1min的錄像,然后使用計(jì)數(shù)器對(duì)錄像結(jié)果進(jìn)行大型蚤跳動(dòng)次數(shù)的計(jì)數(shù),每個(gè)視頻計(jì)數(shù)三次。

      2.4 PE和PVC對(duì)大型蚤蛋白質(zhì)含量的影響

      取暴露21 d的大型蚤,超純水沖洗干凈并吸干水分后稱重,加入3 mL0.9%的生理鹽水,在冰水浴條件下超聲破碎 15 min機(jī)械勻漿,勻漿液于高速冷凍離心機(jī)中4℃、15000 r·min-1離心10 min后,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定大型蚤蛋白質(zhì)含量。步驟:準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白,溶于100 mL蒸餾水中,即為100 ug·mL-1的原液。稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250,溶于50 mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100 mL,最后用蒸餾水定容到250 mL。取6 支10 mL 干凈的離心管,按表1 取樣。蓋塞后混合,放置2 min 后用1 cm 光經(jīng)的比色杯在595 nm 波長(zhǎng)下比色,記錄各管測(cè)定的光密度OD595 nm,并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 mL 離心管 ,按下表取樣。吸取提取液0.2 mL,放入離心管 中,加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250 蛋白試劑,充分混合,放置2 min 后用1 cm 光徑比色杯在595 nm 下比色,記錄光密度OD 595 nm,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X(μg)。

      2.5 數(shù)據(jù)處理

      實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用origin8.0進(jìn)行處理和作圖,采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),并用Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析檢驗(yàn),p<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果采用means±SD的方法。

      3.結(jié)果與討論

      3.1 PE和PVC對(duì)大型蚤的急性毒性

      圖1為PE和PVC對(duì)模式生物大型蚤24h、48h、72h、96h的急性毒性影響結(jié)果。由圖可得出,在濃度為12.5mg·L-1的PE和PVC暴露組,模式生物大型蚤均出現(xiàn)死亡,隨著時(shí)間的推移,尤其以PVC暴露下的大型蚤死亡率最為明顯,而PE暴露組大型蚤死亡率則微有波動(dòng)。兩種微塑料對(duì)模式生物大型蚤的致死作用會(huì)隨著時(shí)間的推移而加大,由圖可見(jiàn),微塑料PVC暴露組下的大型蚤死亡率增大較微塑料PE暴露組明顯。微塑料PE暴露組在24h急性毒性作用下,模式生物大型蚤未出現(xiàn)死亡,也說(shuō)明了微塑料PE對(duì)大型蚤的急性致死作用要稍低于微塑料PVC。微塑料PE在分散劑Tween80作用下在純水中呈懸浮狀態(tài),而微塑料PVC呈現(xiàn)乳濁液,所以隨著時(shí)間的增加模式生物大型蚤的死亡率增大,微塑料PE暴露組50mg·L-1濃度下,大型蚤的死亡率和400mg·L-1濃度暴露組相當(dāng),原因是隨著時(shí)間的推移,微塑料PE慢慢聚集,50mg·L-1濃度下微塑料聚集度不高剛好可以被大型蚤攝取,而100mg·L-1和200mg·L-1濃度下的微塑料PE聚集度過(guò)大,導(dǎo)致大型蚤無(wú)法攝取。微塑料對(duì)大型蚤的致死原因不僅表現(xiàn)在大型蚤攝入體內(nèi)產(chǎn)生的消化道等堵塞,還會(huì)纏在大型蚤身上,使得大型蚤游動(dòng)能力下降而死亡,所以在400mg·L-1濃度下,大型蚤死亡的原因可能是游動(dòng)能力受到了束縛而致死。微塑料PVC在純水中呈乳濁液,隨著時(shí)間增加,會(huì)有部分沉在燒杯底部,所以其對(duì)大型蚤的致死情況也表現(xiàn)出在微塑料100mg·L-1與400mg·L-1濃度下相當(dāng)。

      實(shí)驗(yàn)求得PE和PVC對(duì)大型蚤的LC50-96h值分別為107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1。李勤和方海燕等分別了考察了不同粒徑大小的PVC對(duì)大型蚤的急性毒性作用發(fā)現(xiàn),15 μm的PVC微塑料對(duì)大型蚤L(zhǎng)C50-96h為130.1 mg·L-1 [7];2 μm的PVC對(duì)大型蚤48 h LC50為20.5 mg·L-1 [8],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)。

      3.2 PE和PVC對(duì)大型蚤脫皮數(shù)和心率的影響

      經(jīng)過(guò)21d的微塑料PE和PVC的慢性暴露,各濃度組僅有少數(shù)大型蚤死亡。微塑料PE暴露組12.5mg·L-1濃度第10天死亡1只、50mg·L-1濃度第19天死亡1只、100mg·L-1濃度第6天死亡1只;微塑料PVC暴露組6mg·L-1濃度第13天和第17天各死亡1只。脫皮數(shù)是大型蚤生長(zhǎng)的一個(gè)指標(biāo),大型蚤每脫一次皮代表大型蚤生長(zhǎng)發(fā)育一回。微塑料PE和PVC兩種藥物暴露21d的慢性毒性試驗(yàn),每天觀察大型蚤的繁殖代謝情況,記錄每只母蚤在實(shí)驗(yàn)期間的蛻皮數(shù),21d后統(tǒng)計(jì)總脫皮數(shù)。微塑料PE暴露組從小到大各個(gè)濃度下21d大型蚤的脫皮總數(shù)分別為61個(gè)、61個(gè)、69個(gè)、57個(gè);微塑料PVC暴露組從小到大各個(gè)濃度下21d大型蚤的脫皮總數(shù)分別為77個(gè)、76個(gè)、73個(gè)、71個(gè),與對(duì)照組脫皮數(shù)84個(gè)相比均低于對(duì)照組。表明兩種藥物暴露阻礙了大型蚤的生長(zhǎng),對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。

      試驗(yàn)21 d后于XD-202倒置生物顯微鏡下測(cè)定大型蚤心率,由圖2大型蚤于兩種微塑料中暴露21 d后的心率變化結(jié)果可見(jiàn),12.5~100 mg·L-1 PE作用下大型蚤的心率分別相當(dāng)于對(duì)照值的81.5%、79.8%、72.8%和70.1%;3~24 mg·L-1 PVC作用下的大型蚤的心率分別相當(dāng)于對(duì)照值的89.4%、80.1%、69.9%和61.8%,均顯著低于對(duì)照。說(shuō)明在兩種微塑料藥物的暴露下,大型蚤的心臟功能發(fā)生了變化,會(huì)降低機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)的速率,導(dǎo)致大型蚤對(duì)攝入體內(nèi)的食物的消化吸收能力降低,從而加速大型蚤的死亡。對(duì)比兩種微塑料對(duì)大型蚤心率的影響來(lái)看,微塑料PE暴露組大型蚤的心率呈現(xiàn)陡坡式下降,而微塑料PVC暴露組大型蚤的心率呈直線型下降。且兩種微塑料的最高濃度組PVC24 mg·L-1的心率比 PE100 mg·L-1的心率更低,由此可以看出,微塑料PVC暴露組對(duì)大型蚤心率的影響較微塑料PE暴露組更大。

      3.3 PE和PVC對(duì)大型蚤蛋白質(zhì)含量的影響

      蛋白質(zhì)是評(píng)價(jià)大型蚤營(yíng)養(yǎng)狀況的指標(biāo)之一,當(dāng)大型蚤長(zhǎng)時(shí)間暴露在微塑料中,微塑料會(huì)進(jìn)入大型蚤消化道造成消化道堵塞,導(dǎo)致大型蚤攝入體內(nèi)的食物長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法消化,體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低;再者,大型蚤把微塑料當(dāng)成食物攝入體內(nèi)造成飽腹感,而微塑料在體內(nèi)無(wú)法被大型蚤消化吸收,所以導(dǎo)致大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降。

      由圖3大型蚤于兩種微塑料中暴露21 d后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果可見(jiàn),微塑料PE暴露組隨著濃度的增加,模式生物大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)呈階梯型下降的趨勢(shì)。而相對(duì)于微塑料PE暴露組,微塑料PVC暴露組大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著濃度逐漸增大下降的趨勢(shì)比較平緩,尤其是濃度0~12 mg·L-1 大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量下降趨勢(shì)微小,而濃度為24mg·L-1 大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著下降。我們猜測(cè),微塑料PE經(jīng)分散劑Tween80分散后在純水中呈懸浮狀,顆粒較大,大型蚤攝入體內(nèi)后產(chǎn)生的飽腹感以及造成腸道堵塞的程度大,所以隨著濃度的增加,大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量呈明顯的下降趨勢(shì)。而微塑料PVC經(jīng)分散劑Tween80分散后是乳濁液,形態(tài)與大型蚤攝入體內(nèi)的食物斜生柵藻相似,在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)大型蚤腸道內(nèi)的堵塞程度不明顯,大型蚤對(duì)食物的消化能力沒(méi)有受到很大程度上的限制,但當(dāng)微塑料PVC濃度達(dá)到一定程度,大型蚤腸道堵塞嚴(yán)重,影響了其對(duì)食物的消化,抑制了體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,所以當(dāng)濃度為24 mg·L-1 時(shí),大型蚤體內(nèi)蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)了急劇降低的現(xiàn)象。

      4.結(jié)論與應(yīng)用前景展望

      (1) 96 h的急性毒性試驗(yàn)求得5 μm粒徑的PE和PVC對(duì)大型的LC50-96h值分別為107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1,表明相同條件下PVC對(duì)大型蚤的急性毒性較PE更強(qiáng)。

      (2) PE和PVC兩種微塑料暴露21 d后,較高濃度的PE和PVC對(duì)大型蚤生長(zhǎng)和繁殖等生命活動(dòng)均具有顯著影響。表現(xiàn)為大型蚤的脫皮數(shù)減少,在XD-202倒置生物顯微鏡下測(cè)得的大型蚤心率下降,說(shuō)明兩種藥物對(duì)大型蚤的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。

      (3) PE和PVC兩種微塑料暴露21d后,模式生物大型蚤體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量隨著藥物濃度的升高而呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì),表面兩種微塑料對(duì)大型蚤的營(yíng)養(yǎng)狀況產(chǎn)生了危害作用。

      (4)微塑料是一種新型環(huán)境污染物,成為了近年來(lái)比較熱門(mén)的研究對(duì)象,國(guó)內(nèi)對(duì)微塑料毒性的探索還在比較淺層的階段。微塑料不僅會(huì)對(duì)水環(huán)境、大氣環(huán)境、土壤環(huán)境等造成危害,而且對(duì)生物及人類的危害是不可估量的。由于微塑料毒害的潛在性和漫長(zhǎng)性,人們?nèi)菀缀鲆曀拇嬖?,但是現(xiàn)階段對(duì)微塑料的研究以及探索解決微塑料污染的辦法是人們亟待解決的問(wèn)題。對(duì)微塑料毒性的探索是一個(gè)永無(wú)止境的過(guò)程,它將會(huì)是人類探索道路上的一大挑戰(zhàn)。

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      [7]李勤,李尚諭,熊雄,等.2021.微塑料對(duì)大型溞的急性毒性研究[J].水生生物學(xué)報(bào),45(2):1-7.

      [8]方海燕,謝冰寒,侯淼淼,等.2021.PVC微塑料對(duì)大型溞繁殖及應(yīng)激與能量相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),41(5):2056-2062.

      作者簡(jiǎn)介:祝慧玲(1998-),籍貫:浙江衢州人,浙江樹(shù)人大學(xué),大學(xué)本科,毒理學(xué)方向。

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