閆 函，許真真，李 靜，劉建國

(中國石油大學(華東) 化學工程學院，山東 青島 266580)

堿性蛋白酶(EC 3.4.21.14)是一類能夠催化蛋白質水解的生物酶，廣泛存在于動物、植物和微生物體中[1-2]。目前，微生物來源的堿性蛋白酶已經(jīng)成為最重要的工業(yè)水解酶類之一，占工業(yè)應用總量的65%以上，主要用于洗滌劑生產(chǎn)、皮革加工、銀回收、制藥、食品加工以及廢物處理等[3]。但相對日益增長的市場需求，堿性蛋白酶依然是資源緊缺的蛋白酶種類[4]，特別是具有耐鹽特性的堿性蛋白酶，仍無法滿足高鹽度加工行業(yè)(如咸味動植物蛋白風味食品加工)的需求[5]。

近年來，為了獲得性質優(yōu)良的耐鹽耐堿蛋白酶，人們將研究重點集中于嗜鹽古菌[6-7]和海洋微生物[8-9]。但是嗜鹽古菌的生長速度普遍較慢，而蛋白酶的產(chǎn)量較低[6]。此外，已有的海洋微生物來源的堿性蛋白酶的耐鹽性并不理想，限制了該酶在高鹽行業(yè)中的應用[8]。因此，尋找耐鹽耐堿蛋白酶的新來源依然是堿性蛋白酶工作的重要任務。

我國內蒙古自治區(qū)地處中高緯地區(qū)，氣候干燥，多風少雨，地形和氣候條件有利于堿湖的形成，而堿湖的高鹽環(huán)境為嗜鹽嗜堿微生物的生長提供了理想條件。本實驗室前期從內蒙古堿湖水樣中篩選出一株嗜鹽嗜堿菌，經(jīng)鑒定為鹽螺旋菌。本研究對該菌生產(chǎn)的耐鹽耐堿蛋白酶的分離純化及酶學性質的分析，這是鹽螺旋菌屬來源堿性蛋白酶的首次報道。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52由作者實驗室從內蒙古自治區(qū)堿湖水樣中篩選獲得，已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：CCTCC NO. M 2020375。

培養(yǎng)基：胰蛋白胨的質量濃度10.0 g/L，酵母提取物的質量濃度5.0 g/L，氯化鈉的質量濃度30.0 g/L，利用碳酸鈉溶液調pH至10.0。

1.2 粗酶液的制備

將鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52按5%接種量接種至滅菌后的LBH培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 rpm的條件下培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)后的發(fā)酵液于4 ℃、8 000 rpm離心15 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3 蛋白酶的分離純化

取500 mL粗酶液，在低溫攪拌下加入硫酸銨粉末，使其飽和度為75%。待硫酸銨完全溶解后，將溶液在4 ℃靜置12 h，10 000 rpm離心20 min，將沉淀溶于20 mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)中，透析過夜。將樣品上至凝膠過濾層析柱Superdex 200 GL進行分離，流動相為20 mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.5)，按峰接樣，通過活性檢測，確認蛋白酶所在的樣品，最后利用截留分子量為3 kDa的濃縮離心管，將蛋白酶樣品進行濃縮。

1.4 蛋白酶的活性測定

利用福林酚法測定蛋白酶的活性[10]。取質量分數(shù)1.0%的酪蛋白溶液2.5 mL (pH 7.5)，于40 ℃恒溫水浴5 min，加入0.5 mL純化后的蛋白酶溶液，快速混勻，于40 ℃恒溫10 min，然后向體系中加入2.5 mL三氯乙酸溶液(0.4 M)終止反應。將混合溶液于12 000 rpm離心10 min，取1.0 mL上清液先后與2.5 mL碳酸鈉溶液(0.4 M)、1.0 mL Folin試劑混合，40 ℃恒溫顯色30 min，在680 nm處測定樣品的吸光度。蛋白酶活力單位(U)定義為：在上述條件下，1 min內水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量[11]。

1.5 蛋白酶純度及總蛋白質含量分析

純化后的蛋白酶純度采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。另外，溶液中的總蛋白質含量采用Bradford法進行測定[12]。

1.6 溫度對蛋白酶活性的影響

將蛋白酶活性測定方法中的酶(蛋白酶)與底物(酪蛋白)反應溫度分別設置為30、40、50、60、70、80和90 ℃, 保持其他測活過程及參數(shù)不變，將最高酶活定義為100%，計算各溫度下的相對酶活。

1.7 pH對蛋白酶活性的影響

將蛋白酶與底物酪蛋白反應體系的pH分別調整為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0，保持其他測活過程及參數(shù)不變，同樣將最高酶活定義為100%，計算不同pH下的相對酶活。調整溶液pH所用的緩沖溶液為：Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.0～9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖溶液(pH 9.0～13.0)。

1.8 鹽度對蛋白酶活性的影響

向蛋白酶與底物酪蛋白反應體系中分別加入終濃度為1.0、2.0、3.0和4.0 M的氯化鈉，保持測活過程的其他參數(shù)不變，考察NaCl濃度對蛋白酶活性的影響。

1.9 金屬離子、EDTA和PMSF對蛋白酶活性的影響

向蛋白酶與底物酪蛋白反應體系中分別加入終濃度為0.5 mM的金屬離子(Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Mg2+、Hg2+、Fe3+)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，保持測活過程的其他參數(shù)不變，以未添加金屬離子的樣品活性為100%，計算各樣品的相對酶活。

1.10 有機溶劑和表面活性劑對蛋白酶活性的影響

向蛋白酶與底物酪蛋白反應體系中分別加入終濃度為5%(V/V)的有機溶劑(二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)、苯、甲醇、乙醇、丙酮和正己烷)和表面活性劑(十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、吐溫40、吐溫80和曲拉通X-100)，保持測活過程的其他參數(shù)不變，以未添加有機溶劑的樣品活性為100%，考察有機溶劑對蛋白酶活性的影響。

1.11 蛋白酶動力學常數(shù)的測定

利用20 mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)分別配制質量分數(shù)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的酪蛋白溶液，測定5種不同濃度酪蛋白底物的酶活，使用Leonora軟件[13]計算動力學常數(shù)Km和Vmax。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的分離與純化

采用硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析相結合的方法，對鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52分泌的胞外蛋白酶進行了分離純化。由表1可知，蛋白酶在粗酶液中的比酶活為321.2 U/mg，經(jīng)硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析分離后，其比酶活分別增加至1 254.7和3 962.2 U/mg，純化倍數(shù)分別為3.9倍和12.3倍，總酶活回收率為55.8%。

表1 蛋白酶的純化結果Tab. 1 Purification of the protease

M—標準蛋白；I—粗酶液；II—純化后的蛋白酶圖1 蛋白酶聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果Fig. 1 SDS-PAGE analysis of the protease

圖1是蛋白酶樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果?？梢钥闯?，蛋白酶的分子量約為38 kDa。此外，經(jīng)凝膠成像軟件分析得知，純化后的蛋白酶純度約為98.6%。

2.2 溫度對蛋白酶活性的影響

圖2是溫度對蛋白酶活性的影響結果。由圖可知，20～50 ℃范圍內，蛋白酶的活性隨溫度的升高而增加，當溫度超過50 ℃以后，蛋白酶的活性逐漸降低。因此，鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶的最適溫度為50 ℃，該數(shù)值與OceanobacillusiheyensisO.M.A18[14]和HaloalkaliphilicbacteriumSj-1[15]來源蛋白酶的最適溫度相同。另外，由圖2還可以看出，該蛋白酶在90 ℃時，依然能夠保持73%的最高酶活，表明該酶可以在高溫下使用。

圖2 溫度對蛋白酶活性的影響Fig. 2 Effect of temperature on protease activity

2.3 pH對蛋白酶活性的影響

圖3是蛋白酶在不同pH下的活性測定結果。可以看出，在pH 7.0～13.0范圍內，蛋白酶的活性呈先增加后下降的趨勢，并在pH 9.0處獲得最大酶活。需要說明的是，pH 9.0處的兩個數(shù)據(jù)點是因為使用了兩種不同的緩沖溶液造成的。因此，鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶的最適pH為9.0。根據(jù)堿性蛋白酶的定義可知[16]，該蛋白酶為堿性蛋白酶。

另外，由圖3還可得知，鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源的蛋白酶在pH 7.0～13.0范圍內，均能保持80%以上的最大酶活，這種現(xiàn)象在之前報道的所有蛋白酶中從未發(fā)現(xiàn)，但這一特殊性質能夠使該酶在更復雜的環(huán)境中使用。

圖3 pH對蛋白酶活性的影響Fig. 3 Effect of pH on protease activity

2.4 鹽度對蛋白酶活性的影響

鹽度對蛋白酶活性的影響結果如圖4所示。可以看出，雖然鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源的蛋白酶在未加入氯化鈉時的活性最高，但加入氯化鈉對該酶的活性影響很小。當氯化鈉濃度從1.0 M增加至4.0 M時，該蛋白酶的活性基本沒有變化，且都保持90%的最大酶活。表明鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源的蛋白酶對鹽度具有優(yōu)良的耐受性，這也是迄今報道的活性受鹽度影響最小的堿性蛋白酶。

圖4 NaCl濃度對蛋白酶活性的影響Fig. 4 Effect of NaCl concentrations on protease activity

2.5 金屬離子、EDTA和PMSF對蛋白酶活性的影響

表2是金屬離子對鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶活性的影響結果。由表可知，Ca2+、Mg2+、Cu2+對蛋白酶的活性有促進作用，Mn2+、Zn2+和Hg2+對蛋白酶的活性基本無影響，Ni2+對蛋白酶的活性有中度抑制作用，而Co2+、Fe3+對蛋白酶活性有嚴重抑制作用。毛丙永等[17]同樣報道了Fe3+對米曲霉來源耐鹽蛋白酶的活性起抑制作用，但也發(fā)現(xiàn)Ca2+和Cu2+對蛋白酶的活性有抑制作用，這與本研究的結果不符。此外，Gupta等[18]發(fā)現(xiàn)Mg2+對Bacillussp.來源堿性蛋白酶的活性基本無影響。這些情況表明，相同的金屬離子對不同來源蛋白酶的活性影響不同，這可能與蛋白酶的結構有關，且這種現(xiàn)象在其他酶類中已有報道[19]。

此外，由表2還可以看出，金屬螯合劑EDTA對鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶的活性有促進作用，說明該酶的催化活性不需要金屬離子的配合。絲氨酸蛋白酶抑制劑MPSF對該蛋白酶的活性有中度抑制作用，表明鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源的蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶。

表2 金屬離子、EDTA和PMSF對蛋白酶活性的影響Tab. 2 Effects of metal ions, EDTA and PMSF on protease activity

2.6 有機溶劑和表面活性劑對蛋白酶活性的影響

有機溶劑對蛋白酶活性的影響結果如圖5所示。由圖可知，所考察有機溶劑(二甲基甲酰胺、苯、甲醇、乙醇、丙酮和正己烷)對鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶的活性基本無影響或起輕微的促進作用。這表明該蛋白酶具有一定的耐有機溶劑特性，這一性質也使得該酶能夠在低水活度下應用。

圖5 有機溶劑對蛋白酶活性的影響Fig. 5 Effect of organic solvents on protease activity

洗滌劑是蛋白酶工業(yè)應用的重要領域。為此，考察了表面活性劑SDS、吐溫40、吐溫80和曲拉通X-100對鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶活性的影響。結果表明，吐溫40和吐溫80對蛋白酶的活性有促進作用，而SDS和曲拉通X-100對蛋白酶的活性基本無影響。

2.7 蛋白酶的動力學參數(shù)

酶的動力學參數(shù)對于酶反應器設計和開發(fā)酶在不同條件下的應用至關重要，因其對于酶、底物和反應條件均具有特異性。經(jīng)測定、分析得知，鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶的動力學常數(shù)Km和Vmax分別為1.6 mg/mL和673 U/mL。其Km值小于Bacillussp.來源蛋白酶的Km值(2.5 mg/mL)[18]，這說明鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源的蛋白酶對酪氨酸的親和力更強。

3 結語

對鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源的蛋白酶的分離純化及性質進行了研究。結果表明，經(jīng)硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析純化后，得到的蛋白酶的比酶活為3 962.2 U/mg，純度為98.6%。該蛋白酶的最適溫度和pH分別為50 ℃和pH 9.0，且該酶在30～90 ℃、pH 7.0～13.0及氯化鈉濃度1.0～4.0 M范圍內，均能保持較高的活性。Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+和Hg2+對蛋白酶的活性有促進作用或無影響。另外，所考察的有機溶劑二甲基甲酰胺、苯、甲醇、乙醇、丙酮和正己烷對蛋白酶的活性有輕微的促進作用或無影響。這些優(yōu)良的性質，將進一步拓寬鹽螺旋菌Salinispirillumsp. LH52來源蛋白酶的應用領域。