基于酶活性的抑菌作用研究進(jìn)展

鄧欣彤， 胡婕妤， 劉玲麗， 朱韻琪， 周雨蝶， 陳焱婷， 王 欣， 白雪蓮

（ 杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 311121）

酶（ Enzyme） 是活細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或RNA，對(duì)其底物具有很高的特異性和催化效率。 酶是一種生物催化劑， 能使細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的物質(zhì)代謝過(guò)程有序進(jìn)行， 使物質(zhì)代謝適應(yīng)正常的生理功能， 主導(dǎo)著生物的新陳代謝、 營(yíng)養(yǎng)和能量轉(zhuǎn)換等許多催化過(guò)程，與生命活動(dòng)密切相關(guān)的反應(yīng)大多是酶催化的反應(yīng)。若由于一些原因造成酶的活性減弱， 均可導(dǎo)致該酶催化的反應(yīng)異常， 使物質(zhì)代謝紊亂， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞， 甚至細(xì)胞死亡。 主要對(duì)細(xì)胞壁、 細(xì)胞膜、 體內(nèi)代謝、 遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄4 個(gè)過(guò)程中的部分酶類進(jìn)行了概述， 探究酶在抑菌作用中受到的影響。

1 細(xì)胞壁相關(guān)酶類

真菌的生存有賴于細(xì)胞壁， 如稻瘟病菌的生長(zhǎng)發(fā)育、 極性分生孢子的萌發(fā)、 芽管的定向生長(zhǎng)和感染菌絲的生長(zhǎng)， 這些都涉及到細(xì)胞壁的動(dòng)態(tài)變化[1-2]。冒慧穎等人[3]研究表明， 幾丁質(zhì)酶基因參與尖孢鐮刀菌的致病過(guò)程可影響病原菌致病力。 幾丁質(zhì)和葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分， 幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶可以降解致病菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和葡聚糖成分， 導(dǎo)致致病菌菌絲的分解[4-5]。 李明等人[6]根據(jù)其研究結(jié)果推測(cè)檸檬醛抑制稻瘟病菌的殺菌作用與幾丁質(zhì)酶密切相關(guān)， 可作為靶標(biāo)酶進(jìn)行殺菌作用的研究。 某些化合物可以激活β-1,3 葡聚糖酶、 幾丁質(zhì)酶的活性來(lái)阻止病原菌細(xì)胞壁的合成， 從而引起激活物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)或引起病原菌自噬， 最終達(dá)到病害防治的效果[7-8]。

1.1 幾丁質(zhì)酶

1.1.1 幾丁質(zhì)（降解） 酶

幾丁質(zhì)酶（Chitinase） 是稻瘟病菌細(xì)胞壁降解的關(guān)鍵酶， 能催化幾丁質(zhì)水解生成N- 乙酰氨基葡萄糖[9-10]。 幾丁質(zhì)酶可通過(guò)降解病原體內(nèi)的幾丁質(zhì)， 破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 干擾新陳代謝， 從而達(dá)到抑菌的目的。 劉雪等人[11]研究表明， 經(jīng)苯丙烯菌酮處理后的稻瘟病菌， 其幾丁質(zhì)酶活性增加， 可破壞稻瘟病菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)， 起到抑菌作用。 Li R Y 等人[12]研究表明，檸檬醛可以提高幾丁質(zhì)酶活性， 從而破壞稻瘟病菌細(xì)胞壁的完整性， 達(dá)到抗菌目的。 李珊等人[13]研究發(fā)現(xiàn)， 比基尼鏈霉菌HD-087 產(chǎn)生的脂肽可以誘導(dǎo)稻瘟病菌菌絲體β-1,3 葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性增加、幾丁質(zhì)基因和β-1,3 葡聚糖基因表達(dá)上調(diào)， 導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶和β-1,3 葡聚糖酶快速積累， 導(dǎo)致病菌細(xì)胞壁被破壞。

1.1.2 幾丁質(zhì)合成酶（CHS）

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的重要成分， CHS 是幾丁質(zhì)生物合成中的關(guān)鍵酶。 幾丁質(zhì)的合成受到干擾或沉積， 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁的缺失破損， 對(duì)真菌生長(zhǎng)繁殖造成影響。 CHS 是N- 乙酰葡糖胺（ UDP-GlcNAc）催化合成幾丁質(zhì)的必要酶， 在幾丁質(zhì)的合成中起決定性作用。 代猛等人[14]研究發(fā)現(xiàn)， CHS 不僅在維持細(xì)胞生長(zhǎng)方面起著重要作用， 而且與其致病能力密切相關(guān)， 在真菌原生質(zhì)體的再生方面起著非常重要的作用。 Yutani M 等人[15]研究發(fā)現(xiàn)反式茴香腦能通過(guò)抑制CHS 的活性起到抗真菌作用。 葉文雨等人[16]研究發(fā)現(xiàn)不同的幾丁質(zhì)合成酶基因在不同RhoGAP 基因突變體中的表達(dá)量不同， 總體趨勢(shì)是上調(diào)的， 說(shuō)明RhoGAP 基因家族蛋白可以通過(guò)調(diào)控幾丁質(zhì)合酶的表達(dá)水平來(lái)參與稻瘟病菌不同階段細(xì)胞壁的合成。

1.2 β-1,3 葡聚糖酶

1.2.1 β- 1,3 葡聚糖（降解） 酶

β-1,3 葡聚糖酶（ β-1,3-GA） 是一類能水解以β-1,3 葡萄糖苷鍵連接的葡聚糖酶系， 是真菌細(xì)胞壁的主要成分之一， 可直接水解真菌菌絲上的葡聚糖，從而抑制菌絲的生長(zhǎng)。 β-1,3 葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶都對(duì)真菌細(xì)胞壁正常發(fā)育具有重要影響， 二者通常成對(duì)研究比較。 朱華珺等人[17]研究表明， 枯草芽孢桿菌分泌的β-1,3 葡聚糖酶能抑制稻瘟病菌的生長(zhǎng)。 陳剛等人[18]研究表明球毛殼菌可產(chǎn)生β-1,3 葡聚糖酶對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)抑制作用明顯。

1.2.2 β- 1,3 葡聚糖合成酶

β-1,3 葡聚糖是由β-1,3 葡聚糖合成酶催化的，該合成酶主要由催化亞基Fks 和調(diào)節(jié)亞基Rho1 組成， 但也可能涉及其他蛋白質(zhì)[19]。 β-1,3 葡聚糖合成酶抑制劑是一類新型抗真菌抗生素， 通過(guò)抑制葡聚糖合成酶干擾細(xì)胞壁的合成， 產(chǎn)生抗真菌作用。Armstrong-jamed D P 等人[20]研究表明， 在粗糙脈胞菌中， 具有抗菌特性的殼聚糖可以顯著降低導(dǎo)致β-1,3葡聚糖合成（fks） 與延伸（gel-1） 相關(guān)基因的表達(dá)。

1.3 N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase）

N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶廣泛存在于微生物中，可以協(xié)同內(nèi)切、 外切幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)分解為N- 乙酰氨基葡萄糖， 其在參與自然界氮循環(huán)中的作用非常重要。 在微生物體內(nèi)， NAGase 同時(shí)還具有促進(jìn)生物體自溶、 形態(tài)改變和營(yíng)養(yǎng)代謝的作用[21]。 楊萍等人[22]研究發(fā)現(xiàn)， 立枯絲核菌細(xì)胞壁水解物可以誘導(dǎo)棘孢木霉N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶活性顯著增加， 對(duì)立枯絲核菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

1.4 纖維素酶（Cx）

病原菌細(xì)胞壁中含有少量纖維素， 纖維素酶是水解纖維素成小分子物質(zhì)的酶， 是一種包含多組分的復(fù)合酶， 各組分協(xié)同作用降解細(xì)胞壁。 楊萍等人[22]研究表明， 棘孢木霉通過(guò)分泌纖維素酶水解細(xì)胞壁中的纖維素來(lái)破壞病原菌的細(xì)胞壁。 王桂清等人[23]研究表明， 遼細(xì)辛精油對(duì)灰葡萄孢菌的纖維素酶具有抑制作用， 酶活抑制率與精油濃度呈正比， 說(shuō)明對(duì)Cx 酶的抑制作用可能是遼細(xì)辛精油對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌機(jī)制之一。

2 細(xì)胞膜合成酶類

2.1 肌醇磷酰鞘氨醇合成酶（IPC 合成酶）

鞘類磷脂是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分， 肌醇磷酰鞘氨醇合成酶是真菌鞘類磷脂的生物合成的關(guān)鍵酶[24]。 鞘類磷脂生物合成途徑中的IPC 合成酶是真菌所特有的， 已被證明是藥物作用的理想靶標(biāo)。 Tan H W 等人[25]研究表明aureobasidin 對(duì)IPC 合成酶起抑制作用， 阻止真菌鞘類磷脂生物合成。

2.2 α-1,4 去甲基化酶

麥角固醇（ 又稱麥角甾醇） 作為真菌細(xì)胞膜的重要組成成分， α-1,4 去甲基化酶是細(xì)胞膜麥角固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。 缺乏麥角甾醇會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的喪失。 大多數(shù)常用的抗真菌藥物都是針對(duì)麥角甾醇生物合成中必需的關(guān)鍵酶設(shè)計(jì)的抑制劑， 其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與關(guān)鍵酶結(jié)合， 抑制麥角甾醇合成， 使真菌的細(xì)胞膜受到破壞， 從而抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖。 Gamarra S 等人[26]研究發(fā)現(xiàn)， 唑類藥物可抑制α-1,4 去甲基化酶， 阻止麥角甾醇生物合成， 對(duì)真菌細(xì)胞膜造成損傷， 增加膜通透性， 產(chǎn)生抗真菌作用。 甾醇合成抑制劑的主要作用機(jī)制是抑制甾醇合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性， 如三唑酮主要的靶點(diǎn)為甾醇14-α 去甲基化酶CYP51， 通過(guò)抑制CYP51 酶的活性使甾醇合成前體的14-α 位不能正常去甲基化而抑制甾醇的有效合成， 進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[27-28]。

3 參與體內(nèi)代謝的酶類

3.1 合成代謝酶

過(guò)氧化物酶（ POD） 廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中， 不僅能消除自由基， 幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧量，還能與過(guò)氧化氫酶協(xié)同解毒細(xì)胞內(nèi)的有毒物質(zhì)， 防止水稻受到活性氧的侵害。 過(guò)氧化物酶的活性受到抑制， 使菌絲膜系統(tǒng)和菌體蛋白質(zhì)對(duì)內(nèi)外環(huán)境更敏感， 從而影響微生物代謝。 林志偉等人[29]研究表明，黃綠木霉菌發(fā)酵液在一定程度上可以使稻瘟病菌POD酶活性下降， 對(duì)于稻瘟病菌的呼吸影響十分顯著。

谷氨酰胺合成酶（GS） 是一種參與生物體氮代謝和碳代謝的酶， 也是用于合成L- 谷氨酰胺（L-Gln） 過(guò)程中的關(guān)鍵酶， 現(xiàn)已在細(xì)菌、 真菌和植物中廣泛研究了涉及谷氨酰胺代謝的基因。 楊帆等人[30]研究表明蘇云金芽胞桿菌glnA 基因受glnR 的調(diào)控， 在氮源豐富的條件下， glnR 可以抑制glnA 的轉(zhuǎn)錄； 而在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下， glnR 基因缺失會(huì)導(dǎo)致谷氨酰胺合成酶基因glnA 的表達(dá)增加。 白婧等人[31]研究表明重組菌BJ2 有最高的GS 酶活力， 利于L-Gln 的合成， 從而最終得到高產(chǎn)量的L-Gln。

非核糖體肽合成酶（ NRPS） 是一種多功能酶，可以在沒(méi)有核糖體參與的情況下整合短肽[32]， 合成的非核糖體多肽類次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能具有多樣性， 是活性物質(zhì)的重要組成部分[33]。 在許多真菌中，如旋孢腔菌（Cochliobolus）、 鐮刀菌（Fusarium） 、 葡萄灰霉菌（Botrytis） 等都富含NRPS 基因[34-35]。 稻瘟病菌中的NRPS 在病原菌適應(yīng)各種環(huán)境、 干擾寄主代謝并最終導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡的過(guò)程中發(fā)揮作用[36]。

3.2 分解代謝酶

過(guò)氧化氫酶（CAT） 是生物防御體系的一大關(guān)鍵酶， 絕大多數(shù)需氧微生物都含有CAT， 其主要作用是使過(guò)氧化氫（H2O2） 還原成水和氧氣。 過(guò)氧化氫可以被還原成各種有害的自由基， 氧化細(xì)胞中的各種成分， 引起細(xì)胞病變[37]。 而CAT 可促使H2O2分解， 使之處于較低水平， 從而有效防止有毒物質(zhì)在生物體內(nèi)累積， 使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害， 可反映多種環(huán)境因子對(duì)生物生理生化過(guò)程的影響。 張曉麗[38]研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭的其中一種揮發(fā)物Carvacrol，可以使得稻瘟病菌的CAT 酶活性降低， 解毒力下降，菌體死亡。

海藻糖酶（THL） 可以將生物體內(nèi)的海藻糖水解為2 分子葡萄糖， 在真菌代謝系統(tǒng)中有十分重要的作用。 海藻糖存在于真菌孢子、 子實(shí)體和菌絲等營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中。 真菌萌發(fā)后， 海藻糖被迅速消耗， 用于真菌的核心代謝和對(duì)特定環(huán)境刺激的應(yīng)答[39]。

胰蛋白酶（ Trypsin） 是致病真菌的重要毒力因子。 真菌胞外胰蛋白酶參與真菌侵染的過(guò)程， 減緩宿主細(xì)胞的增殖、 減少宿主細(xì)胞的黏附[40]。 韓志萍等人[41]研究顯示， 從放線菌中提取的leupeptin 對(duì)桔黃賽多孢菌胰蛋白酶有100%的抑制效果， 其次是從利馬豆中提取的LBTI， 其抑制效果也高于95%， 其余專一抑制劑的抑制效果均大于70%。 邵彪等人[42]純化了黑豆胰蛋白酶抑制劑并發(fā)現(xiàn)其對(duì)植物致病蘋果輪紋病菌、 瓜果腐霉病菌和白菜黑斑病菌有明顯抑制作用， 通過(guò)抑制植物病原真菌分泌的蛋白酶活性，干擾其對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解利用， 從而限制和阻礙真菌的生長(zhǎng)。

3.3 氧化還原代謝酶

超氧化物歧化酶（SOD） 是重要的內(nèi)源活性氧清除劑， 能夠催化O2-轉(zhuǎn)化成H2O2和O2， 保持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。 植物在逆境下出現(xiàn)的傷害或植物對(duì)逆境的抵抗能力往往與體內(nèi)SOD 活性相關(guān)。 活性氧的積累， 傷害了植物的細(xì)胞膜系統(tǒng)， 同時(shí)也可以直接殺傷病原菌、 作為信號(hào)分子等作用參與植物抗病性的表達(dá)。 宋福強(qiáng)等人[43]研究表明， 用菌株B.ochroleuca 發(fā)酵產(chǎn)物處理的F.oxysporum.sp cucumebrium 和A.solani， 其菌絲體內(nèi)超氧化物歧化酶活性明顯降低， 破壞了菌絲體的生物膜， 抑制菌絲的生長(zhǎng)而死亡。 沈鳳俊等人[44]研究表明， 銀杏酸使球黑孢霉細(xì)胞膜通透性變高， 菌絲體蛋白質(zhì)外泄， 降低了球黑孢霉菌絲體中SOD 酶活力， 對(duì)球黑孢霉呈現(xiàn)抑制作用。

多酚氧化酶（PPO） 普遍存在于植物、 真菌、 昆蟲的質(zhì)體中， 可催化醌和單寧的合成， 醌類參與細(xì)胞壁物質(zhì)的合成及代謝， 能與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成聚合物， 限制病原菌的擴(kuò)展。 鄧勛等人[45]研究表明， 在逆境脅迫下， 前期樟子松枯梢病菌的多酚氧化酶活性呈上升趨勢(shì)， 發(fā)揮對(duì)菌體的保護(hù)作用， 到了后期由于氧自由基和膜脂過(guò)氧化的加重， 使細(xì)胞透性增加， 蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重， 最終導(dǎo)致各種酶含量的降低， 造成菌體死亡。 朱琳等人[46]研究表明受抑制的致病疫霉菌絲體內(nèi)PPO 酶活性顯著下降。

琥珀酸脫氫酶（ SDH） 是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈的關(guān)鍵酶。 其活性直接影響電子傳遞鏈和呼吸氧化， 在呼吸鏈和三羧酸循環(huán)中極其重要[47]。 同時(shí)，SDH 是細(xì)胞能量代謝的重要酶， 其活性變化可反映細(xì)胞的能量代謝情況。 李麗萍等人[48]研究發(fā)現(xiàn)， 紫莖澤蘭的活性物質(zhì)對(duì)番茄青枯菌有明顯的抑制作用，抑制某些蛋白質(zhì)的合成， 降低SDH 的比活力， 導(dǎo)致影響菌的代謝。 李沖偉等人[49]研究發(fā)現(xiàn)金黃殼囊孢菌菌絲體細(xì)胞的SDH 酶活受到了木霉提取物的抑制和破壞， 導(dǎo)致整個(gè)TCA 循環(huán)的停滯。

4 參與DNA 或RNA 轉(zhuǎn)錄過(guò)程的酶類

轉(zhuǎn)錄是遺傳信息從DNA 流向RNA 的過(guò)程， 一旦轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到抑制， 阻止遺傳物質(zhì)的合成， 導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡。 目前， 國(guó)內(nèi)外對(duì)于病原菌中參與DNA 或RNA 轉(zhuǎn)錄過(guò)程酶類的研究較少， 基于更多相關(guān)酶活性對(duì)病原菌抑制作用有待進(jìn)一步研究。

4.1 尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（UPRT） 是一種嘧啶合成補(bǔ)救酶， 可特異性作用于尿嘧啶及其類似物， 可催化合成嘧啶核苷酸前體UMP。 基因編碼UPRT 的反向篩選標(biāo)記基因尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（upp） ， 將胸腺嘧啶類似物5- 氟尿嘧啶（5-FU） 轉(zhuǎn)化為5- 氟單磷酸脫氧尿嘧啶， 從而抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[50]。

4.2 DNA 聚合酶

DNA 聚合酶是以親代DNA 為模板， 催化底物dNTP 分子聚合形成子代DNA 的一類酶。 孫峋等人[51]研究表明， 迷迭香酸可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致還原糖和蛋白質(zhì)的滲漏， 影響細(xì)胞代謝， 并通過(guò)抑制DNA 聚合酶的活性來(lái)影響DNA 復(fù)制， 從而起到抑菌作用。

4.3 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶

DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶就是調(diào)控核酸代謝的關(guān)鍵酶之一， 其可催化DNA 鏈的解旋和斷裂， 完成DNA 的復(fù)制、 轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。 抑制酶活性可以穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA 復(fù)合體， 從而抑制翻譯和復(fù)制， 最終阻礙DNA 合成和細(xì)胞分裂， 導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 喜樹堿及其衍生物在體外能有效抑制新型隱球菌拓?fù)洚悩?gòu)酶I 的活性， 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑依賴于泊苷對(duì)念珠菌的抗菌活性較弱[52]。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述， 已有眾多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 抑菌物質(zhì)可通過(guò)對(duì)病原菌的幾丁質(zhì)酶、 β-1,3 葡聚糖酶、 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、 纖維素酶、 IPC 合成酶、 α-1,4 去甲基化酶、 過(guò)氧化物酶等酶活性的作用， 抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖。 目前， 國(guó)內(nèi)外研究中， 基于細(xì)胞壁相關(guān)酶（ 幾丁質(zhì)酶、 β-1,3 葡聚糖酶） 活性研究抑制作用的報(bào)道較多， 但其他酶類研究報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究， 從而能更全面、 更有力地論證抑菌物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制機(jī)制。