柞蠶微粒子病潛在生物標(biāo)志物的挖掘

孫 影,梁瑞業(yè),張文娟,王 勇,3,姜義仁,3,*,秦 利,3,*

(1.沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院,遼寧撫順 113122;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,沈陽(yáng) 110866; 3.遼寧省昆蟲資源工程技術(shù)研究中心,沈陽(yáng) 110866)

柞蠶Antheraeapernyi是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，近幾年我國(guó)柞蠶放養(yǎng)面積基本穩(wěn)定在80萬(wàn)hm2左右，年產(chǎn)柞蠶繭8萬(wàn)噸以上(封槐松和李建琴,2016)。柞蠶幼蟲期生活在野外，各種病害嚴(yán)重影響柞蠶繭的產(chǎn)量及質(zhì)量，往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，柞蠶微粒子病是柞蠶生產(chǎn)中唯一的檢疫性病害，該病害既可水平傳播又可垂直傳播，已成為制約柞蠶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問(wèn)題之一(秦利,2003)。目前，柞蠶生產(chǎn)上對(duì)于該病的防控仍一直沿用雌蛾顯微鏡檢查的方法，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確性受人為因素影響較大，不僅給柞蠶制種工作帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)，而且難以保證種卵質(zhì)量。因此，開發(fā)柞蠶微粒子病的檢測(cè)方法對(duì)于保障柞蠶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。

代謝組學(xué)是一種研究生物體內(nèi)代謝的系統(tǒng)方法，主要以分子量在1 000以下的小分子代謝物為研究對(duì)象，通過(guò)比較不同狀態(tài)生物樣本中低分子量代謝物信息，反映生物體對(duì)病理生理刺激、遺傳修飾和周圍環(huán)境的反應(yīng)，相比于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝譜更接近于對(duì)疾病過(guò)程的反應(yīng)，在很多疾病的早期診斷、監(jiān)測(cè)及致病機(jī)理等方面具有廣泛的應(yīng)用潛力(Nicholsonetal.,1999,2002;Gowdaetal.,2008;Emwasetal.,2013;Zengetal.,2017)。利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)掘新型生物標(biāo)志物已是很多研究領(lǐng)域廣泛采用的策略，包括癌癥(Chengetal.,2011;Tumasetal.,2016)、糖尿病(Savolainenetal.,2017;Zengetal.,2017)、慢性病(Mastrangelo and Barbas,2017)及健康老齡化(Almeidaetal.,2021)等重要疾病研究。柞蠶微粒子病的病原物為柞蠶微孢子蟲Nosemapernyi，微孢子蟲侵染會(huì)造成柞蠶體內(nèi)蛋白質(zhì)在種類及含量上發(fā)生顯著的變化，導(dǎo)致柞蠶生理或病理過(guò)程發(fā)生改變(姜義仁等,2012;臧敏等,2012)，推測(cè)在柞蠶微粒子病發(fā)生過(guò)程中柞蠶體內(nèi)的代謝物也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。本研究以健康及患柞蠶微粒子病雌成蟲血淋巴為材料，采用代謝組學(xué)技術(shù)分析健康與患病柞蠶雌成蟲血淋巴內(nèi)代謝物差異，篩選差異代謝物，挖掘病害的潛在生物標(biāo)志物，為開發(fā)柞蠶微粒子病的檢測(cè)方法提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柞蠶沈黃2號(hào)雌成蟲由遼寧省昆蟲資源工程技術(shù)研究中心提供。隨機(jī)挑選剛羽化柞蠶雌成蟲若干，冰上快速采集血淋巴，并對(duì)采血后雌成蟲進(jìn)行顯微鏡檢查，鏡檢出微孢子蟲的雌成蟲(患微粒子病)的血淋巴標(biāo)記為M組，鏡檢健康的雌成蟲的血淋巴標(biāo)記為H組，所有樣品液氮冷凍后置于-80℃冰箱中備用。

1.2 代謝物提取

取25 μL冰上解凍后的柞蠶雌成蟲血淋巴樣品，加入250 μL 50%甲醇溶液，震動(dòng)充分混勻，提取樣品中的代謝物，常溫靜置10 min；提取液放置-20℃過(guò)夜，沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，4 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液到96孔板；利用稀釋液(異丙醇∶乙腈∶水=2∶1∶1，體積比)稀釋代謝物提取液，樣品稀釋液作為代謝物上樣樣品，每組各取6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品中等量取出10 μL稀釋液混合作為質(zhì)控(quality control,QC)樣品。所有樣品代謝物提取液上樣前保存于-80℃冰箱。

1.3 液相色譜及質(zhì)譜條件

利用超高效液相色譜儀(ExionLC,SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,Waters)；采用高分辨率質(zhì)譜儀TripleTOF5600plus飛行時(shí)間質(zhì)譜(SCIEX，英國(guó))進(jìn)行代謝物采集，每個(gè)樣本進(jìn)行一次正離子模式采集和一次負(fù)離子模式采集，正離子模式的噴霧電壓為5 000 V，負(fù)離子模式的噴霧電壓為-4 500 V，儀器參數(shù)設(shè)置參照鄭海英等(2019)方法。

1.4 代謝物注釋和定量分析

1.4.1代謝物注釋：利用Proteowizard的MSConver軟件將原始文件轉(zhuǎn)換成mzXML文件，將mzXML文件導(dǎo)入XCMS軟件進(jìn)行代謝物峰提取、保留時(shí)間矯正。利用CAMERA軟件進(jìn)行代謝物同位素、加和離子分析；利用metaX軟件結(jié)合KEGG和HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝物注釋，質(zhì)量誤差為10 ppm；對(duì)質(zhì)譜二級(jí)碎片數(shù)據(jù)與in-house代謝物標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)圖譜庫(kù)進(jìn)行匹配、打分，提取相似性>80%的代謝物。

1.4.2代謝物定量分析：利用XCMS軟件(Smithetal.,2006)提取所有樣品的所有代謝物強(qiáng)度信息，采用metaX軟件(Wenetal.,2017)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。去質(zhì)量峰(QC樣品中缺失超過(guò)50%或?qū)嶋H樣品中缺失超過(guò)80%的離子)；利用KNN(k-nearest neighbor)方法進(jìn)行缺失值補(bǔ)充；利用PQN(probabilistic quotient normalization)算法對(duì)所有樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化，再利用QC樣品進(jìn)行QC-RSC(QC-robust spline batch correction)校正；對(duì)校正后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去掉不穩(wěn)定的代謝物，即在QC樣品中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation,RSD)>30%的離子。

1.5 差異表達(dá)代謝物篩選及其功能分析

使用metaX軟件進(jìn)行單變量和多變量分析獲得健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品間差異表達(dá)代謝物。采用單變量分析對(duì)每組6個(gè)生物學(xué)重復(fù)測(cè)代謝物強(qiáng)度的平均值計(jì)算其在健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品間的比值(ratio)，即差異表達(dá)倍數(shù)(fold change)，利用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果作多重檢驗(yàn)分析，主要利用BH(Benjamini-Hochberg)校正得到P值；結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)建立代謝物表達(dá)量和樣品類別之間的關(guān)系模型，建立健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品之間的PLS-DA模型，同時(shí)對(duì)該模型參數(shù)R2和Q2進(jìn)行了置換檢驗(yàn)，次數(shù)為200次，進(jìn)而得到每個(gè)代謝物的變量重要性(variable importance,VIP)值；顯著差異表達(dá)代謝物同時(shí)滿足：ratio≥2或ratio≤1/2,P<0.05,VIP≥1。

2 結(jié)果

2.1 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴代謝物統(tǒng)計(jì)

為探討柞蠶微粒子病雌成蟲體內(nèi)代謝物的變化，我們對(duì)柞蠶健康及患微粒子病雌成蟲的血淋巴樣品進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，獲得樣品的代謝物總離子流圖(圖1)。從圖1可知，患病與健康雌成蟲的血淋巴之間代謝物種類存在差異。在正離子模式下獲得8 870個(gè)代謝物，其中注釋代謝物5 390個(gè)，二級(jí)鑒定代謝物312個(gè)；在負(fù)離子模式下獲得6 716個(gè)代謝物，其中注釋代謝物3 848個(gè)，二級(jí)鑒定代謝物177個(gè)。

圖1 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品代謝物質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of metabolites from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometerA:正離子模式In positive ion model;B:負(fù)離子模式In negative ion model;H:健康Healthy;M:患病Sick;QC:質(zhì)控Quality control.下同The same below.

2.2 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴代謝物鑒定

正、負(fù)離子模式下分別鑒定了2 629和1 983個(gè)一級(jí)鑒定代謝物，均被注釋到40個(gè)KEGG二級(jí)代謝通路，兩種模式鑒定的代謝物分別有2 109和1 606個(gè)被分類到新陳代謝(metabolism)中12個(gè)條目，134和107個(gè)被分類到人類疾病(human diseases)中11個(gè)條目，256和159個(gè)被分類到有機(jī)體系統(tǒng)(organismal systems)中9個(gè)條目，8和5個(gè)被分類到細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)中3個(gè)條目，103和82個(gè)被分類到環(huán)境信息處理(environmental information processing)中的3個(gè)條目，19和24個(gè)被分類到遺傳信息處理(genetic information processing)中的2個(gè)條目；在人類疾病二級(jí)通路中，正、負(fù)離子模式下代謝物數(shù)量最多的是癌癥概況(cancers:overview)(分別為75和59個(gè))，其次是抗腫瘤藥物耐藥性(drug resistance:antineoplastic)(分別為12和12個(gè))和神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)(分別為12和8個(gè))，還包括藥物依賴性(substance dependence)(分別為9和6個(gè))、特定類型癌癥(cancers:specific types)(分別為6和5個(gè))、內(nèi)分泌和代謝疾病(endocrine and metabolic diseases)(分別為6和6個(gè))、細(xì)菌性傳染病(infectious diseases:bacterial)(分別為4和3個(gè))和傳染性寄生蟲病(infectious diseases:parasitic)(分別為6和4個(gè))等(圖2)。鑒定代謝物數(shù)量最多的前20個(gè)代謝通路如圖3所示，正、負(fù)離子模式下前3位代謝通路依次為代謝通路(metabolic pathways)(分別為704和516個(gè))、2-氧羧酸代謝(2-oxocarboxylic acid metabolism)(分別為75和72個(gè))和氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(分別為69和68個(gè))。正、負(fù)離子模式下，分別有28 622和20 683個(gè)一級(jí)鑒定代謝物被注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的24個(gè)和22個(gè)功能分類中，前2位功能分類依次為脂和類脂分子(lipids and lipid-like molecules)(分別為16 530和11 223個(gè))和苯丙素類和聚酮化合物(phenylpropanoids and polyketides)(分別為4 959和4 833個(gè))(圖4)。

圖4 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下質(zhì)譜檢測(cè)的一級(jí)鑒定代謝物的HMDB注釋Fig.4 HMDB super class annotation of metabolites primarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

正離子模式下，312個(gè)二級(jí)鑒定代謝物中有293個(gè)被注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的11個(gè)super classes的42個(gè)條目，16個(gè)沒(méi)有被注釋(na)，3個(gè)為未知(unknown)，注釋代謝物數(shù)量前3位的條目分別為甘油磷脂(glycerophospholipids)(67)、脂肪?；衔?fatty acyls)(62)和羧酸及其衍生物(carboxylic acids and derivatives)(34)(圖5:A)；251個(gè)代謝物被注釋到85個(gè)KEGG代謝通路中，其中排名前20位的通路如圖6(A)所示，前3位通路分別為代謝通路(metabolic pathways)(42)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)(12)和蛋白質(zhì)消化和吸收(protein digestion and absorption)(12)。負(fù)離子模式下，177個(gè)二級(jí)鑒定代謝物中有175個(gè)被注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的8個(gè)super classes的25個(gè)條目，2個(gè)沒(méi)有被注釋，前3位分別為甘油磷脂(glycerophospholipids)(71)、羧酸及其衍生物(carboxylic acids and derivatives)(27)和脂肪酰基化合物(fatty acyls)(16)(圖5:B)；213個(gè)代謝物被注釋到85個(gè)KEGG代謝通路中，代謝物數(shù)量前3位通路分別為代謝通路(metabolic pathways)(32)、癌癥的中心碳代謝(central carbon metabolism in cancer)(9)和氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(9)(圖6:B)。

圖5 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下質(zhì)譜檢測(cè)的二級(jí)鑒定代謝物的HMDB注釋Fig.5 HMDB annotation of metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

圖6 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下質(zhì)譜檢測(cè)的二級(jí)鑒定代謝物的前20個(gè)KEGG代謝通路注釋Fig.6 Annotation of top 20 KEGG pathways of metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

2.3 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴代謝物定量

正、負(fù)離子模式下，分別篩選出7 966個(gè)和 6 143個(gè)高質(zhì)量代謝物歸一化后用于統(tǒng)計(jì)分析，二級(jí)鑒定的高可信度代謝物在每個(gè)樣品中的強(qiáng)度分布見圖7。

圖7 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下質(zhì)譜檢測(cè)的二級(jí)鑒定代謝物強(qiáng)度熱圖Fig.7 Heatmap of the intensity of metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

2.4 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴差異表達(dá)代謝物的篩選

以健康組(H)為對(duì)照，篩選微粒子病組(M)差異表達(dá)的代謝物。結(jié)果表明，正離子模式下，篩選到差異表達(dá)代謝物472個(gè)，其中260個(gè)上調(diào)，212個(gè)下調(diào)；負(fù)離子模式下，差異表達(dá)代謝物301個(gè)，其中207個(gè)上調(diào)，94個(gè)下調(diào)。對(duì)兩組各個(gè)樣品的差異表達(dá)代謝物進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖8所示，健康組(H)與微粒子病組(M)的差異表達(dá)代謝物彼此分開。

圖8 健康和患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下質(zhì)譜檢測(cè)的差異表達(dá)代謝物表達(dá)強(qiáng)度熱圖Fig.8 Heatmap of the expression intensity of differentially expressed metabolites identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

2.5 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴差異表達(dá)二級(jí)鑒定代謝物篩選

柞蠶健康雌蛾和患微粒子病雌蛾兩組之間的PLS-DA模型結(jié)果表明，正離子模式下，建立的PLS-DA模型的R2為0.9949，Q2為0.6719(圖9:A)；負(fù)離子模式下，建立的PLS-DA模型的R2為0.9976，Q2為0.7310(圖9:B)，表明正、負(fù)離子模式下構(gòu)建的PLS-DA模型較為可靠，差異表達(dá)代謝物在兩組之間的表達(dá)量能夠較好地將健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品區(qū)分開。

圖9 健康和患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下質(zhì)譜檢測(cè)的差異表達(dá)代謝物PLS-DA得分圖Fig.9 PLS-DA score plot of differentially expressed metabolites identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

篩選出差異表達(dá)的二級(jí)鑒定的代謝物(表1)中正離子模式下，篩選到差異表達(dá)代謝物12個(gè)，其中8個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)；負(fù)離子模式下，篩選到差異表達(dá)代謝物9個(gè)，其中8個(gè)上調(diào)，1個(gè)下調(diào)。

3 討論

本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)分析了柞蠶健康及患微粒子病雌成蟲血淋巴內(nèi)代謝物的差異，了解了柞蠶雌成蟲血淋巴內(nèi)代謝物種類和柞蠶微粒子病對(duì)柞蠶雌成蟲血淋巴內(nèi)代謝物的影響，為深入開展柞蠶微粒子病的檢測(cè)及致病機(jī)理等研究奠定了基礎(chǔ)。本研究中，正離子模式下質(zhì)譜檢測(cè)獲得8 870個(gè)代謝物，其中注釋代謝物5 390個(gè)，篩選到微粒子病組相對(duì)于對(duì)照組健康的差異表達(dá)代謝物472個(gè)，其中260個(gè)上調(diào)，212個(gè)下調(diào)，這些差異表達(dá)代謝物中有二級(jí)鑒定代謝物12個(gè)(8個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào))，分別為纈氨酸(valine)、苯并噻唑(benzothiazole),3-脫羥基肉堿(3-dehydroxycarnitine),1-甲基鳥嘌呤(1-methylguanine)、2-乙氧基萘(2-ethoxynaphthalene)、N6-乙酰基-L-賴氨酸(N6-acetyl-L-lysine)、生物素(biotin)、桑色素(morin)、噻嗎洛爾(timolol)、酰基肉堿15∶0(acylcarnitine 15∶0)、酰基肉堿18∶4(acylcarnitine 18∶4)和異槲皮苷(isoquercitrin)；負(fù)離子模式下獲得6 716個(gè)代謝物，其中注釋代謝物3 848個(gè)，篩選到差異表達(dá)代謝物301個(gè)(207個(gè)上調(diào)，94個(gè)下調(diào))，其中二級(jí)鑒定差異表達(dá)代謝物9個(gè)(8個(gè)上調(diào)，1個(gè)下調(diào))，分別為二甲基丙二酸(dimethylmalonic acid)、戊二酸(glutaric acid)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)、1,3-二乙?；?1,3-diacetylpropane)、3-(4-羥基苯基)乳酸(DL-p-hydroxyphenyllactic acid)、泛酸(pantothenate)、熒光素(fluorescein)、飛燕草素-3-O-beta-吡喃葡萄糖苷(delphinidin-3-O-beta-glucopyranoside)和溶血磷酯酰肌醇16∶1(lysoPI 16∶1)(表1)。

表1 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品質(zhì)譜二級(jí)鑒定的差異表達(dá)代謝物統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical analysis of differentially expressed metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer

目前，關(guān)于柞蠶代謝組方面的研究報(bào)道較少，本研究鑒定到這些差異代謝物可能與柞蠶微粒子病的病程相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。這21個(gè)二級(jí)鑒定差異表達(dá)代謝物分別注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的8個(gè)super classes，其中包括苯型烴類(benzenoids)(2)、脂和類脂分子(lipids and lipid-like molecules)(3)、有機(jī)酸及其衍生物(organic acids and derivatives)(5)、有機(jī)化合物(organic compounds)(1)、有機(jī)氮化合物(organic nitrogen compounds)(1)、有機(jī)氧化合物(organic oxygen compounds)(1)、有機(jī)金屬雜環(huán)化合物(organoheterocyclic compounds)(4)和苯丙素類和聚酮化合物(phenylpropanoids and polyketides)(4)(圖5)。本研究發(fā)現(xiàn)，柞蠶微粒子病組的3-脫羥基肉堿顯著上調(diào)表達(dá)，差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到了20.96，有意思的是在糖尿病(Zengetal.,2017)、紅肉消費(fèi)及其相關(guān)疾病(Romboutsetal.,2017)等研究中該代謝物同樣也上調(diào)表達(dá)。有研究表明，3-脫羥基肉堿為腸道細(xì)菌分解代謝左旋肉堿(L-carnitine)的中間代謝物，推測(cè)腸道微生物可能參與到糖尿病進(jìn)程(Kleber,2006;Koethetal.,2014)。柞蠶微粒子病會(huì)嚴(yán)重影響柞蠶幼蟲的營(yíng)養(yǎng)消化吸收功能(姜義仁等,2012)，推測(cè)柞蠶微孢子蟲也可能通過(guò)影響柞蠶幼蟲腸道微生物而參與到柞蠶微粒子病進(jìn)程。這些差異代謝物在柞蠶微粒子病發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，具有潛在的生物標(biāo)志物功能。雖然本研究?jī)H按照柞蠶制種生產(chǎn)的操作程序進(jìn)行取樣及初步分析了患柞蠶微粒子病及健康雌蛾血淋巴的差異代謝物，但發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)技術(shù)在柞蠶微粒子病研究中具有積極的應(yīng)用價(jià)值及潛力。我們后續(xù)研究中將結(jié)合柞蠶微粒子病的分子檢測(cè)手段來(lái)進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏性來(lái)確保取樣的準(zhǔn)確性，并計(jì)劃以柞蠶幼蟲為材料進(jìn)行人工添食微孢子蟲孢子，深入探討侵染時(shí)期及孢子濃度等對(duì)柞蠶體內(nèi)代謝物產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步揭示柞蠶微粒子病的致病機(jī)理及開發(fā)病害診斷檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。