梁惠玲 鐘家友 王飛清 李艷菊 趙嘉寧 楊?yuàn)?劉燕青 安仕剛 劉洋

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類消化系統(tǒng)的惡性侵襲性腫瘤，其發(fā)病隱匿、惡變率高、病程速度快、復(fù)發(fā)率高〔1〕。我國每年新發(fā)病例已超過17萬，并且每年以4.2%的速度增長，遠(yuǎn)超2%的國際增長水平〔2～4〕。結(jié)直腸癌治療手段主要以手術(shù)、放化療及中草藥抗腫瘤為主，但結(jié)直腸癌的治療及預(yù)后并不理想，術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者死亡的主要因素〔5～7〕。近年大力挖掘地方民族醫(yī)藥防治結(jié)直腸癌是很多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，以期為攻克結(jié)直腸癌這一重大腫瘤疾病提供線索。多年生草本天門冬因其富含皂苷、黃酮、微量元素等多種成分，現(xiàn)作為重點(diǎn)發(fā)展的貴州傳統(tǒng)苗藥材得以大力種植。研究證實(shí)苗藥天門冬是一種具有抗腫瘤、抗氧化、增加人體免疫力等功效的天然藥物〔8～10〕。為此，本研究通過細(xì)胞水平驗(yàn)證貴州天然苗藥天門冬作用于結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，其增殖、遷移及P53和P21基因表達(dá)水平，為結(jié)直腸癌的治療和新藥開發(fā)開拓思路。

1 材料與方法

1.1材料 LOVO結(jié)直腸癌細(xì)胞系由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所提供，胎牛血清(以色列BI公司，批號(hào)：04-001-1ACS)，細(xì)胞培養(yǎng)基高糖(H)-DMEM(美國GIBCO公司)，含乙二胺四乙酸(EDTA)0.25%胰蛋白酶：碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品，PCR試劑盒：全式金生物公司，CCK-8試劑盒：日本同仁公司，Trizol試劑盒：Invitrogen公司，二甲基亞砜(DMSO)：索萊寶公司，結(jié)晶紫染液：索萊寶公司。

1.2主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)；Olympus顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Leica DMI6000 B電動(dòng)倒置熒光相差顯微鏡(萊卡公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)。

1.3天門冬水煎劑制備 天門冬水煎劑制備：精密稱取天門冬50 g，加10倍量水稱重，回流提取2次，1 h/次，抽濾，用水補(bǔ)足減少的重量，藥液在70℃減壓濃縮，得濃度為1 g/ml天冬水提取液，取濃縮液1 ml加水稀釋至5 ml，1 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，LOVO細(xì)胞給藥濃度為40 μl/ml H-DMEM培養(yǎng)基。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將LOVO細(xì)胞置于37℃，飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)均用含10%熱滅活胎牛血清，1%的抗生素(青霉素100 mg/L和鏈霉素100 mg/L)的DMEM完全培養(yǎng)基。細(xì)胞呈單層生長，達(dá)80%左右融合時(shí)，采用0.25%的胰酶消化液消化傳代，取生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5結(jié)晶紫染色 選擇第3代LOVO細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，按照1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度分別接種于24孔板中，每組設(shè)有3個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基為800 μl。待細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)50%后，給予天門冬水煎劑40 μl/ml(天門冬組)，培養(yǎng)24 h進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。以不加天門冬水煎劑為空白組。

1.6CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 選擇第3代LOVO細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，按照2×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度分別接種于96孔板中，每組設(shè)有6個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基為200 μl。待細(xì)胞貼壁生長后，每隔24 h檢測細(xì)胞生長情況，每孔加入20 μl CCK-8試劑，3 h后用酶標(biāo)儀(波長450 nm)檢測吸光度值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的LOVO細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞融合度達(dá)80%，用無菌20 μl槍頭在每個(gè)孔底劃出“十”字劃痕，用生理鹽水洗2遍，拍照記錄后減血清培養(yǎng)基饑餓處理4 h后加入40 μl/ml天門冬水煎劑(天門冬組)，并設(shè)立空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后在顯微鏡下觀察劃痕愈合度，拍照記錄，并分析細(xì)胞的遷移情況。

1.8侵襲實(shí)驗(yàn) 天門冬作用結(jié)直腸癌細(xì)胞后，隨后取出5×104細(xì)胞接種于8 μm Transwell上室，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，下室加入對(duì)照培養(yǎng)基。 孵箱中孵育12 h后，上室使用3%多聚甲醛固定10 min，吉姆薩染色15 min后，使用顯微鏡對(duì)遷移至上室背側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.94′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)檢測細(xì)胞凋亡 將LOVO細(xì)胞接種于24孔板，密度為5×104/孔，細(xì)胞接種后待細(xì)胞貼壁，去除原培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入天門冬水煎劑，空白組加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育2 d后，多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入5 mg/L DAPI染液，5 min后用PBS沖洗3遍，顯微鏡下采集圖像。

1.10Real-Time PCR測定細(xì)胞中P53和P21 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明書具體方法進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量-反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因片段擴(kuò)增并定量。各PCR反應(yīng)管中所加模板RNA的量約為1 μg。P53和P21 PCR擴(kuò)增條件為：Real-time PCR：95℃ 5 s，59℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95℃ 5 s，65℃ 5 s，60個(gè)循環(huán)。結(jié)果通過RT PCR儀記錄的Ct值對(duì)起始模板相對(duì)定量分析。

1.11數(shù)據(jù)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 高倍顯微鏡下可見空白組的細(xì)胞成群貼壁生長，細(xì)胞透亮，折光性好，核圓而大，細(xì)胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)分布均勻。天門冬組細(xì)胞之間互相脫離，與周圍細(xì)胞脫離，形態(tài)改變貼壁不牢，細(xì)胞破碎，結(jié)果見圖1。

圖1 LOVO細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果(×200)

2.2天門冬對(duì)LOVO細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與空白組比較，天門冬組LOVO細(xì)胞的侵襲率明顯下調(diào)〔(280.3±9.5)個(gè) vs (176.7±15.3)個(gè);t=9.980，P=0.001〕，見圖2。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后空白組遷移率明顯高于天門冬組〔(54.67±2.52)% vs (40.33±1.53)%;t=8.433,P=0.001〕，結(jié)果進(jìn)一步說明天門冬對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制其遷移的藥效作用，見圖3。

圖2 天門冬作用LOVO細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(×200)

圖3 天門冬作用結(jié)直腸癌 LOVO細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×100)

2.3天門冬對(duì)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞增殖的影響 天門冬對(duì)LOVO細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，第3～6天天門冬組細(xì)胞增殖率顯著低于空白組，結(jié)果見表1。

表1 天門冬作用結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞增殖率

2.4DAPI染色熒光結(jié)果 LOVO細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)其細(xì)胞核呈現(xiàn)致密核染或呈碎塊致密核染，天門冬組LOVO細(xì)胞可見明顯細(xì)胞核解體的現(xiàn)象，且細(xì)胞密度較低，細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組(P<0.05)，見表2、圖4。

圖4 天門冬作用結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞DAPI染色結(jié)果(×100)

2.5天門冬作用LOVO細(xì)胞后凋亡基因的變化 與空白組相比，天門冬組P53和P21 mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，見表2。

表2 兩組凋亡率及P53、P21 mRNA的表達(dá)

3 討 論

結(jié)直腸癌患者術(shù)后采用中醫(yī)藥配合化療或放療，既可相互協(xié)同殺滅腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)放化療的敏感性，又可減少和改善放化療的不良反應(yīng)，提高放化療的治療效果，降低結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，改善患者的生活質(zhì)量，延長生存期〔11〕。

天門冬作為貴州傳統(tǒng)苗藥材近年在醫(yī)療市場得以重點(diǎn)發(fā)展，《神農(nóng)本草經(jīng)》將天門冬列為上品其后歷代本草均有收載，現(xiàn)為常用中藥之一，其活性成分和藥效評(píng)價(jià)一直是本課題組研究重點(diǎn)。我們前期研究報(bào)道貴州產(chǎn)天門冬明顯具有對(duì)O2-和·OH的清除及抑制作用，證實(shí)了天門冬是有效的氧自由基清除劑〔12～14〕。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖過盛和凋亡抑制被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵〔15，16〕。臨床中應(yīng)用的抗腫瘤藥主要目的是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這也是藥物抗腫瘤的重要機(jī)制之一〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色和CCK-8結(jié)果顯示，天門冬水煎劑作用結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞后，抑制LOVO細(xì)胞增殖，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天門冬水煎劑作用結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞后，抑制LOVO細(xì)胞侵襲和遷移作用。通過檢測細(xì)胞凋亡基因P53和P21 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LOVO細(xì)胞在天門冬作用后P53和P21 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)DAPI細(xì)胞熒光染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了天門冬可促進(jìn)LOVO細(xì)胞凋亡，這可能為天門冬抑制結(jié)直腸癌的重要調(diào)控機(jī)制。

綜上，苗藥天門冬可抑制結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞的增殖，侵襲，并促進(jìn)LOVO細(xì)胞凋亡，其凋亡路徑可能是通過天門冬作用LOVO細(xì)胞后增加P53和P21凋亡基因?qū)崿F(xiàn)的。隨著對(duì)天門冬藥理作用及其機(jī)制的深入了解，這將為天門冬在臨床防治腫瘤方面提供有效的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。