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      石蒜堿下調(diào)RACK1抑制口腔鱗癌細胞增殖、凋亡

      2021-12-08 11:15:40梁源邵建民楊旭楊文超萬兵
      中國老年學雜志 2021年23期
      關(guān)鍵詞:堿組石蒜細胞株

      梁源 邵建民 楊旭 楊文超 萬兵

      (1漯河醫(yī)學高等??茖W校,河南 漯河 462002;2漯河市中心醫(yī)院)

      口腔鱗狀細胞癌(OSCC)起病隱匿、惡性程度高,具有生存率低、病死率高等特點〔1〕。目前,伴隨生活條件的改善、壽命的增長及環(huán)境污染等因素的改變,OSCC的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,發(fā)病年齡亦趨向年輕化〔2〕。目前該病主要采用手術(shù)、放療、化療及中醫(yī)等療法,雖已取得較大進展,但治療后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率依然較高〔3〕。因此,尋找低毒性、高選擇性的抗OSCC藥物,是目前急需解決的課題。石蒜堿為一種異喹啉類生物堿,主要從石蒜鱗莖分離純化出來,具有良好的抗病毒、抗炎、抗腫瘤活性〔4〕。然而石蒜堿對OSCC的影響鮮有報道?;罨牡鞍准っ窩1受體(RACK1)為一種支架蛋白,其在多種腫瘤中均有表達,并呈現(xiàn)明顯的高表達。研究〔5〕發(fā)現(xiàn),RACK1低表達顯著抑制OSCC細胞的增殖,促進細胞凋亡。但目前關(guān)于RACK1與石蒜堿誘導的OSCC細胞增殖、凋亡調(diào)控關(guān)系還不太明確。因此,本研究針對石蒜堿抗OSCC作用與RACK1的關(guān)系進行了研究,為OSCC研究提供參考。

      1 材料與方法

      1.1材料 人OSCC CAL-27細胞株購自上海慧穎生物科技有限公司。石蒜堿購自南京景竹生物科技有限公司,高效液相色譜(HPLC)≥98%,含0.1%DMSO的DMEM配置成不同濃度;兔抗人Ki67、增殖細胞核抗原(PCNA)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、RACK1抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗購自美國,Sigma公司;RACK1 Human siRNA購自O(shè)rigene公司,美國。倒置熒光顯微鏡購自Nikon Corp;酶標儀購自美國,BioTek。

      1.2方法

      1.2.1細胞培養(yǎng) CAL-27細胞株接種到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),胰蛋白酶消化傳代。

      1.2.2細胞活力檢測 取對數(shù)期密度為1×104個/ml CAL-27細胞株接種于96孔板,100 μl/孔,24 h貼壁后棄上清。加入含有石蒜堿的DMEM 100 μl,石蒜堿終濃度分別為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L,對照組只加等量的培養(yǎng)基。每孔重復(fù)3次。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每孔加入CCK-8 10 μl,培養(yǎng)2 h,于450 nm測定光密度值(A),計算細胞活力。抑制率(%)=1-(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)×100。實驗重復(fù)3次。

      1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率 5.00、2.50、1.25 μmol/L石蒜堿作用于對數(shù)期CAL-27細胞株48 h后,胰酶消化,1 200 r/min,離心半徑17.39 cm,離心5 min,收集細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕重懸細胞并計數(shù)。 取5萬重懸的細胞,1 200 r/min,離心半徑17.39 cm,離心5 min,棄上清,加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞,加5 μl Annexin V-FITC,10 μl PI,混勻,培養(yǎng)15 min,立即進行流式細胞儀分析。

      1.2.4Western印跡 總蛋白常規(guī)提取,二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。20 μl蛋白樣品加樣,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%山羊血清封閉1 h,加入一抗(Ki67、 PCNA、Bcl-2、Bax、RACK1和β-actin的稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000和1∶1 000),4℃孵育過夜,HRP標記的二抗孵育2 h,凝膠成像系統(tǒng)成像,并進行灰度分析。

      1.2.5敲低RACK1的表達對CAL-27細胞株增殖的影響 細胞分組:對照組、石蒜堿組、石蒜堿+RACK1 siRNA組。其中石蒜堿干預(yù)濃度為2.50 μmol/L,依據(jù)分組計劃,RACK1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后,加入石蒜堿繼續(xù)培養(yǎng),48 h后,采用CCK-8法檢測細胞活力,方法同1.2.2。

      1.2.6敲低RACKl的表達對CAL-27細胞株凋亡的影響 參照1.2.5分組,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,方法同1.2.3。 Western印跡檢測Bcl-2、Bax水平,方法同1.2.4。

      1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、LSD-t法。

      2 結(jié) 果

      2.1石蒜堿對CAL-27細胞增殖的影響 CCK-8實驗結(jié)果表明,CAL-27細胞抑制率組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(F組間=7.408,P<0.05);同時抑制率隨著時間延長,呈增長趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(F時間=91.276,P<0.05);并且處理因素與時間有交互作用(F交互=9.438,P<0.05)。其中48 h時石蒜堿對CAL-27細胞IC50為7.635 μmol/L。而0.1%的DMSO 48 h時的抑制率為(4.73±0.05)%。見表1。同時,石蒜堿處理48 h后,與對照組比較,1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿能顯著降低增殖蛋白Ki67、PCNA水平(P<0.05)。見圖1,表2。

      表1 石蒜堿對CAL-27細胞增殖的影響

      1~4:對照組、石蒜堿1.25 μmol/L組、石蒜堿2.50 μmol/L組、石蒜堿5.00 μmol/L組;圖3、4同圖1 石蒜堿對增殖標記蛋白的影響

      表2 石蒜堿對增殖標記蛋白的影響

      2.2石蒜堿對CAL-27細胞凋亡的影響 對照組細胞凋亡率為(3.5±0.4)%,1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿處理后凋亡率分別為(12.4±1.2)%、(20.4±1.3)%、(30.6±1.4)%。與對照組比較,1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿處理后細胞凋亡率增加明顯(P<0.05)。見圖2。同時,與對照組比較,不同濃度的石蒜堿能明顯提高CAL-27細胞Bax的蛋白水平,降低Bcl-2的蛋白水平,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表3、圖3。

      圖2 石蒜堿對CAL-27細胞凋亡的影響

      表3 石蒜堿對凋亡蛋白的影響

      圖3 Western印跡檢測凋亡蛋白的表達

      2.3石蒜堿對RACK1蛋白的影響 對照組RACK1表達水平為(0.85±0.03),1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿處理后RACK1表達水平分別為(0.64±0.05)、(0.21±0.03)、(0.12±0.02)。與對照組比較,1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L石蒜堿處理后RACK1表達水平均明顯下降(均P<0.05)。見圖4。

      圖4 Western印跡檢測RACK1蛋白的表達

      2.4敲低RACKl的表達對CAL-27細胞株增殖的影響 與對照組比較,石蒜堿組和石蒜堿+RACK1 siRNA組增殖率明顯增加(P<0.05);與石蒜堿組比較,石蒜堿+RACK1 siRNA組增殖率明顯增加(P<0.05)。見表4。

      2.5敲低RACKl的表達對CAL-27細胞株凋亡的影響 與對照組比較,石蒜堿組和石蒜堿+RACK1 siRNA組凋亡率明顯增加(P<0.05);與石蒜堿組比較,石蒜堿+RACK1 siRNA組凋亡率明顯增加(P<0.05)。見圖5。與對照組比較,石蒜堿組和石蒜堿+RACK1 siRNA組明顯提高CAL-27細胞Bax蛋白水平,降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05);與石蒜堿組比較,石蒜堿+RACK1 siRNA組Bax蛋白水平明顯增加,Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見表4、圖6。

      表4 敲低RACKl對石蒜堿調(diào)控增殖、凋亡的影響

      圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

      1~3:對照組、石蒜堿組、石蒜堿+RACK1 siRNA組圖6 敲低RACK1的表達對CAL-27細胞株凋亡蛋白的影響

      3 討 論

      石蒜堿為來源于石蒜鱗莖的異喹啉類生物堿,藥理研究〔6〕顯示,石蒜堿具有誘導腫瘤細胞凋亡作用。研究表明,石蒜堿能抑制結(jié)腸癌HT-29細胞的增殖,誘導肝癌HepG2細胞自噬〔7〕,誘導肺癌NCI-H460細胞凋亡作用〔8〕。但對OSCC細胞的抗腫瘤效果鮮有報道,本研究通過給藥OSCC CAL-27細胞進行體外抗腫瘤研究,結(jié)果提示石蒜堿能通過下調(diào)Ki67和PCNA水平抑制OSCC CAL-27增殖;石蒜堿可誘導OSCC CAL-27細胞凋亡。Bcl-2為抗凋亡基因,而Bax為典型的促凋亡基因。提示石蒜堿能通過調(diào)控經(jīng)典的Bcl-2/Bax信號通路啟動線粒體凋亡,誘導OSCC CAL-27凋亡。石蒜堿調(diào)控癌細胞增殖與多種細胞機制有關(guān),如調(diào)控細胞周期,促進細胞自噬達到細胞凋亡的目的〔7〕。也有研究顯示,石蒜堿調(diào)控細胞增殖和凋亡與MAPK、Akt/smad信號通路密切相關(guān)〔9〕。文獻顯示,RACK1為MAPK、Akt信號通路上游的信號分子,下調(diào)RACK1的表達,可抑制Src/Akt 信號通路活性,抑制人膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲〔10〕。RACK1 為支架蛋白,通過調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成等影響癌細胞的進展。而且RACK1下調(diào)還與肺腺癌化療的敏感性增加有關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果說明石蒜堿抑制OSCC CAL-27細胞增殖,誘導細胞凋亡與調(diào)控RACK1 表達水平有關(guān)。而且通過進一步研究顯示,采用siRNA下調(diào)RACK1 表達的表達水平后,石蒜堿抑制OSCC CAL-27細胞增殖,誘導細胞凋亡作用明顯增強,這也進一步證明石蒜堿調(diào)控OSCC CAL-27細胞增殖和凋亡的與調(diào)控RACK1表達水平有關(guān)。

      總之,石蒜堿能通過調(diào)控RACK1的表達水平調(diào)控OSCC CAL-27增殖,誘導細胞凋亡,可以為口腔鱗癌的治療提供新的靶點,同時也為石蒜堿的開發(fā)提供新的依據(jù)。

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