穆紅光，馬媛媛，姚樹青，馬玉斌，任玉軍，楊敬芳

(1.張家口宣鋼醫(yī)院藥劑科，河北 張家口 075100； 2.河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075100； 3.張家口宣鋼醫(yī)院腎病風(fēng)濕免疫科，河北 張家口075100)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一種腎小管細(xì)胞發(fā)生致癌性轉(zhuǎn)化的疾病[1-2]。由于復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，晚期RCC患者的5年生存率極低(5%～10%)。在診斷時，近30%的RCC患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3]。當(dāng)前，RCC的治療方法包括分子靶向治療，如抗血管生成的酪氨酸激酶抑制劑或哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑，這些藥物已被廣泛用于轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性RCC患者，但多發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且對某些患者的療效并不明確[4]。因此，為改善RCC患者的預(yù)后，有必要充分闡明RCC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，以及尋求新的治療方法。磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)已被鑒定為一種新型的腫瘤標(biāo)志物，在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并由雄激素進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[5-6]。PTEN在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)展以及某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。蛋白激酶B(AKT)屬于跨膜受體家族，在先天免疫中起關(guān)鍵作用。有證據(jù)表明，AKT在腫瘤細(xì)胞中被激活，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[7]。既往研究結(jié)果表明，抑制PTEN表達(dá)可調(diào)控下游基因AKT的水平，從而影響肺癌細(xì)胞增殖和凋亡[8]。淫羊藿苷是一種植物類黃酮苷，是在傳統(tǒng)中草藥植物淫羊藿中發(fā)現(xiàn)的有效藥理成分，其對心腦血管系統(tǒng)、骨骼代謝、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)和性功能具有廣泛的藥理作用，并具有抗炎和抗腫瘤作用[9]。Wang等[10]的研究結(jié)果表明，淫羊藿苷可調(diào)控β連環(huán)蛋白表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和細(xì)胞遷移。目前尚未見淫羊藿苷對RCC的影響及作用機(jī)制的報道，本研究擬探討淫羊藿苷對腎癌OS-RC-2細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制，為RCC的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人腎癌OS-RC-2細(xì)胞(購自上海艾研生物科技有限公司，批號為AJ6011)。

1.1.2 儀器：K3 PLUS型酶標(biāo)儀、FastAmp型熒光定量PCR系統(tǒng)和Essential V6型凝膠成像系統(tǒng)(上海騰名生物科技有限公司)；Axiovert 200型顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)；Attune NxT型流式細(xì)胞儀(北京昊諾斯科技有限公司)；NanoDrop 2000型蛋白定量儀(上海劍凌信息科技有限公司)。

1.1.3 藥品與試劑：淫羊藿苷(武漢東康源科技有限公司，原料藥，純度為99%，批號為56692-2-5)；順鉑(武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司，原料藥，純度為99.5%，批號為15663-23)。RPMI-1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒和TRIzol試劑(上海譜振生物科技有限公司，批號分別為P74318、P20773-5、L59117和P08441)；熒光定量PCR試劑(SYBR Premix EX Taq)、蛋白抽提試劑盒、PTEN、AKT、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、羊抗鼠二抗和化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司，批號分別為AP1096、AJ50073、ABP54442、ABP30047、ABP10005、ABP10016和AJ94221)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：(1)人腎癌OS-RC-2細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2、2%O2、93%N2。(2)分組。①OS-RC-2細(xì)胞組，將人腎癌OS-RC-2細(xì)胞(濃度為5×106個/ml)在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2、2%O2、93%N2；②順鉑組，在OS-RC-2細(xì)胞組培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入順鉑濃度為40 μg/ml[預(yù)實(shí)驗(yàn)計算出順鉑對腎癌OS-RC-2細(xì)胞的半致死濃度(LC50)為80 μg/ml，以1/2 LC50為實(shí)驗(yàn)濃度]；③淫羊藿苷低、高濃度組，分別加入質(zhì)量濃度為20、40 μg/ml的淫羊藿苷[11]。上述各組每孔設(shè)6個平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.2.2 細(xì)胞存活率測定：將腎癌OS-RC-2細(xì)胞(每孔2×104個細(xì)胞)加入到96孔板上，各組按“1.2.1”中方法培養(yǎng)72 h后，每孔加CCK-8試劑10 μl，用酶標(biāo)儀測量波長450 nm處的吸光度(OD)，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(各實(shí)驗(yàn)組OD/OS-RC-2細(xì)胞組OD)×100%。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力測定：將腎癌OS-RC-2細(xì)胞(每孔2×104個細(xì)胞)接種于6孔板中，細(xì)胞融合后，用100 μl無菌移液器進(jìn)行“一”字劃痕，以PBS緩沖液洗去懸浮細(xì)胞，按“1.2.1”中方法培養(yǎng)72 h后，用顯微鏡拍照，測量劃痕寬度，計算遷移距離，遷移距離=0 h時劃痕寬度-72 h時劃痕寬度，遷移距離越大，表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡水平測定：將腎癌OS-RC-2細(xì)胞(每孔5×105個細(xì)胞)接種到6孔板中，按“1.2.1”中方法培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中，并加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 5 μl在25 ℃下孵育20 min，以流式細(xì)胞儀分析凋亡水平。

1.2.5 細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA水平測定：TRIzol試劑從腎癌OS-RC-2細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PCR系統(tǒng)將含有cDNA模板、引物、SYBR Premix EX Taq試劑的混合物進(jìn)行反應(yīng)。PTEN、AKT和U6引物序列由武漢艾美捷科技有限公司合成，序列為PTEN正向5′-TTCCCCAGCAACTAC GTGAC-3′和反向5′-TCTAACAACTGAATGGGCGGG-3′；AKT正向5′-CACGTCTCAGTGCATCACAGA-3′和反向5′-GTGCAGGG TCCGAGGTCGAAT-3′；U6正向5′-CCTGTGACTGAGCCGCT CGTGT-3′和反向5′-ATCATGCAGTCTGTGTGTAACC-3′。熱循環(huán)條件為94 ℃持續(xù)5 min，然后進(jìn)行40個94 ℃持續(xù)10 s，60 ℃持續(xù)20 s和72 ℃持續(xù)10 s的循環(huán)。2-ΔΔCt方法用于確定PTEN、AKT的mRNA表達(dá)的相對定量。

1.2.6 細(xì)胞PTEN、AKT的蛋白水平測定：蛋白抽提試劑盒從腎癌OS-RC-2細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)后，使用蛋白定量儀定量總蛋白，通過電泳分離等量(100 μg)蛋白質(zhì)，然后在300 mA下電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，在室溫(25 ℃)下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，滴加PTEN、AKT和β-actin一抗(1 ∶ 1 000)在4 ℃過夜，然后與二抗孵育2 h后，使用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒對蛋白條帶進(jìn)行可視化，凝膠成像系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以定量蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎癌OS-RC-2細(xì)胞存活率比較

與OS-RC-2細(xì)胞組比較，順鉑組和淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞存活率降低；與順鉑組比較，淫羊藿苷低濃度組細(xì)胞存活率升高，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞存活率降低；與淫羊藿苷低濃度組比較，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞存活率降低，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 四組腎癌OS-RC-2細(xì)胞存活率比較Tab 1 Comparison of survival rate in renal cancer OS-RC-2 cells among four groups n=6)

2.2 腎癌OS-RC-2細(xì)胞遷移能力比較

與OS-RC-2細(xì)胞組比較，順鉑組和淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞遷移距離縮短；與順鉑組比較，淫羊藿苷低濃度組細(xì)胞遷移距離增加，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞遷移距離縮短；與淫羊藿苷低濃度組比較，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞遷移距離縮短，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

A.OS-RC-2細(xì)胞組；B.順鉑組；C.淫羊藿苷低濃度組；D.淫羊藿苷高濃度組；各組0 h時劃痕寬度一樣,72 h時劃痕寬度越窄,說明遷移距離越大A. the OS-RC-2 cell group; B. the cisplatin group; C. the icariin low-concentration group; D. the icariin high-concentration group；the scratch width is the same at 0 h in each group, and the narrower the scratch width at 72 h, the greater the migration distance圖1 四組腎癌OS-RC-2細(xì)胞72 h時劃痕寬度Fig 1 Scratch width of renal cancer OS-RC-2 cells among four groups at 72 h

2.3 腎癌OS-RC-2細(xì)胞凋亡率比較

與OS-RC-2細(xì)胞組比較，順鉑組和淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞凋亡率升高；與順鉑組比較，淫羊藿苷低濃度組細(xì)胞凋亡率降低，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞凋亡率升高；與淫羊藿苷低濃度組比較，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞凋亡率升高，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

2.4 腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA表達(dá)比較

與OS-RC-2細(xì)胞組比較，順鉑組和淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA表達(dá)水平降低；與順鉑組比較，淫羊藿苷低濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA表達(dá)水平升高，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA表達(dá)水平降低；與淫羊藿苷低濃度組比較，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA表達(dá)水平降低，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 四組腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA表達(dá)水平比較Tab 2 Comparison of the mRNA expression levels of PTEN and AKT in renal cancer OS-RC-2 cells among

2.5 腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT的蛋白表達(dá)比較

與OS-RC-2細(xì)胞組比較，順鉑組和淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的蛋白表達(dá)水平降低；與順鉑組比較，淫羊藿苷低濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的蛋白表達(dá)水平升高，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的蛋白表達(dá)水平降低；與淫羊藿苷低濃度組比較，淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的蛋白表達(dá)水平降低，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖3。

A.OS-RC-2細(xì)胞組；B.順鉑組；C.淫羊藿苷低濃度組；D.淫羊藿苷高濃度組A. the OS-RC-2 cell group; B. the cisplatin group; C. the icariin low-concentration group; D. the icariin high-concentration group圖2 四組腎癌OS-RC-2細(xì)胞凋亡率比較Fig 2 Comparison of apoptosis rate in renal cancer OS-RC-2 cells among four groups

表3 四組腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT蛋白表達(dá)水平比較Tab 3 Comparison of the protein expression levels of PTEN and AKT in renal cancer OS-RC-2 cells among four

A.OS-RC-2細(xì)胞組；B.順鉑組；C.淫羊藿苷低濃度組；D.淫羊藿苷高濃度組A. the OS-RC-2 cell group; B. the cisplatin group; C. the icariin low-concentration group; D. the icariin high-concentration group圖3 四組腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT蛋白表達(dá)印跡圖Fig 3 Western blot of the protein expression levels of PTEN and AKT in renal cancer OS-RC-2 cells among four groups

3 討論

RCC全球發(fā)病率每年約升高2%，化學(xué)療法的應(yīng)用顯著改善了RCC的療效，但RCC患者的預(yù)后仍然很差[12]。因此，需要發(fā)現(xiàn)新型的RCC治療藥物。淫羊藿苷為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿和巫山淫羊藿的乙醇提取物，具有抗惡性腫瘤作用，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種作用[13]。蔣紹艷等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可通過上調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3蛋白表達(dá)，抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡。Song等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷通過調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子6(SIRT6)/核因子κB(NF-κB)通路抑制乳腺癌細(xì)胞遷移，從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性。Kim等[16]的研究結(jié)果表明，淫羊藿苷通過上調(diào)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的表達(dá)使人結(jié)腸癌細(xì)胞對凋亡敏感，從而誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，具有抗惡性腫瘤作用。文艷梅等[17]的研究結(jié)果表明，淫羊藿苷可調(diào)控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路的表達(dá)，從而抑制A549細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞存活率、遷移距離較OS-RC-2細(xì)胞組低，凋亡率較OS-RC-2細(xì)胞組高；淫羊藿苷高濃度組細(xì)胞存活率、遷移距離較淫羊藿苷低濃度組低，凋亡率較淫羊藿苷低濃度組高，與上述研究結(jié)果一致，同時說明淫羊藿苷對腎癌OS-RC-2細(xì)胞具有抑制增殖、遷移及促進(jìn)凋亡的作用，且具有濃度依賴效應(yīng)。

PTEN的高表達(dá)參與多種惡性腫瘤的進(jìn)化過程。研究結(jié)果表明，PTEN通過調(diào)節(jié)AKT信號通路，抑制口腔鱗狀癌細(xì)胞增殖和侵襲[18]。此外，PTEN可以使黏著斑激酶去磷酸化，后者會下調(diào)有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。AKT是受PTEN調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子。Kong等[19]研究結(jié)果顯示，上調(diào)PTEN表達(dá)可促進(jìn)AKT的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。AKT被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因子。高水平的AKT表達(dá)增加了人黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且這種調(diào)節(jié)可能與AKT對基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制有關(guān)[20]。AKT與MMP-2、MMP-9的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，表明在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，AKT的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[21-22]。本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷低、高濃度組細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA、蛋白表達(dá)水平較OS-RC-2細(xì)胞組低；且隨著淫羊藿苷濃度的升高，PTEN、AKT的mRNA、蛋白表達(dá)水平呈降低趨勢。說明淫羊藿苷可降低腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA、蛋白的表達(dá)，也說明了淫羊藿苷抗腎癌OS-RC-2細(xì)胞作用與PTEN、AKT表達(dá)之間的潛在聯(lián)系。但是，尚不清楚淫羊藿苷誘導(dǎo)腎癌OS-RC-2細(xì)胞中PTEN、AKT表達(dá)的具體機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，淫羊藿苷對腎癌OS-RC-2細(xì)胞具有抑制增殖、遷移和促進(jìn)凋亡的作用，其機(jī)制與淫羊藿苷可降低腎癌OS-RC-2細(xì)胞PTEN、AKT的mRNA、蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制PTEN/AKT通路的激活有關(guān)。