從炳成 王小姣 李夢(mèng)雅 文麗 王世梅

摘要：以生防菌株白刺鏈霉菌CT205為材料，通過誘變選育高效突變菌株，并探索其生物制劑對(duì)芹菜根腐病的防控效果。菌株CT205經(jīng)UV-LiCl復(fù)合誘變獲得一株遺傳穩(wěn)定、相對(duì)高效的突變菌株U-L-4，液體發(fā)酵其活性物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到42 mg/L，較野生菌株提高55.56%。利用突變株U-L-4固體發(fā)酵，制備生物有機(jī)肥，通過田間試驗(yàn)防控芹菜土傳病害，結(jié)果表明，施用放線菌生物有機(jī)肥可有效防控芹菜根腐病，顯著促進(jìn)植株生長(zhǎng)，芹菜產(chǎn)量增加75.00%，芹菜根際病原真菌-尖胞鐮刀菌數(shù)量顯著降低，改善了芹菜根際微生物群落組成。研究結(jié)果可為生防制劑防控土傳病害提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：誘變育種;生物防控;芹菜根腐病;微生物群落;白刺鏈霉菌

中圖分類號(hào)： S436.36? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）21-0138-05

收稿日期：2021-03-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：41671256）;江蘇省泰州市科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（編號(hào)：TN202015）。

作者簡(jiǎn)介：從炳成（1995—），男，山東濱州人，碩士研究生，研究方向?yàn)橥寥牢⑸?。E-mail：2019103123@njau.edu.cn。

通信作者：王世梅，博士，教授，主要從事微生物發(fā)酵與土傳病害生物防治。E-mail：smwang@njau.edu.cn。

芹菜是傘形科耐寒性蔬菜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有降血壓、清腸利便、利尿消腫等作用[1-2]。近年來芹菜連作普遍，土傳根腐病時(shí)常發(fā)生，嚴(yán)重影響產(chǎn)量[3]。芹菜根腐病致病菌主要有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、側(cè)雄腐霉菌（Pythium paroecandrum）及核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）等，病原菌的孢子或菌核可在土壤中潛伏多年，常規(guī)的物理及化學(xué)手段難以有效根除，生物防控綠色、高效，近年通過生防制劑防控土傳病害的有效案例多有報(bào)道[4]。

放線菌在防控土傳病害、促進(jìn)植株生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，放線菌具有產(chǎn)生拮抗物質(zhì)及改善根際微生物群落結(jié)構(gòu)達(dá)到防控植物病害的作用[5-6]。由于微生物的遺傳不穩(wěn)定性，隨著菌株傳代次數(shù)的增加，拮抗菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力會(huì)下降，經(jīng)過誘變處理可獲得相對(duì)高產(chǎn)的菌株，單一誘變劑誘變微生物的方法很多，但突變株易發(fā)生回復(fù)突變[7]，而多種誘變劑的復(fù)合誘變具有協(xié)同、高效的作用。白刺鏈霉菌（Streptomyces albospinus）CT205是實(shí)驗(yàn)室保存的一株抗菌譜廣泛、對(duì)植物真菌病害具有良好防控效果的生防菌株，其代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)為環(huán)己酰亞胺[8-9]，本研究通過對(duì)菌株CT205進(jìn)行物理和化學(xué)復(fù)合誘變獲得相對(duì)高效的突變株，制備生防制劑，通過田間試驗(yàn)研究其對(duì)芹菜根腐病的生防效果。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株S. albospinus CT205實(shí)驗(yàn)室保存。種子培養(yǎng)基：葡萄糖45.0 g，大豆粉30.0 g，酵母粉5.0 g，CaCO3 5.0 g，去離子水1 L，pH值 7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 20.0 g，可溶性淀粉 30.0 g，大豆粉 8.0 g，CaCO3 3.0 g，蛋白胨2.0 g，NaCl 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 L，pH值8.0。

1.2 高效生防菌的誘變篩選

1.2.1 菌株CT205單孢子懸液制備 白刺鏈霉菌菌株CT205劃線接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，待分生孢子形成，刮取分生孢子制備孢子懸液，無菌脫脂棉過濾去除菌絲體，然后顯微計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)整為108個(gè)/mL。

1.2.2 UV+LiCl復(fù)合誘變及突變株篩選 在直徑90 mm培養(yǎng)皿中加入10 mL孢子懸液，磁力攪拌器放在距離紫外（UV）燈的垂直高度約30 cm處，培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上打開皿蓋，適宜轉(zhuǎn)速緩慢攪動(dòng)，照射時(shí)間設(shè)置0.5、1、2、4、6 min等5個(gè)處理，照射結(jié)束暗處理30 min，孢子懸液系列稀釋后，取10-3、10-4系列稀釋液各100 μL，涂布在含有 0.1%～0.6% LiCl的PDA平板上培養(yǎng)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，28 ℃避光培養(yǎng)，設(shè)置空白處理對(duì)照。菌落長(zhǎng)出后統(tǒng)計(jì)不同處理菌落致死率，選取致死率 70%～80%的處理，挑選與野生型菌落形態(tài)相似或不同的菌落[10]。先以酵母菌為指示菌通過拮抗圈檢測(cè)拮抗活性進(jìn)行初篩，然后通過搖瓶液體發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，即菌株的分生孢子接種在種子培養(yǎng)基中，在28 ℃ 170 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中于相同條件下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液 6 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用生物活性法檢測(cè)發(fā)酵上清液中活性物質(zhì)的含量[11]，在此基礎(chǔ)上選擇傳代穩(wěn)定、效價(jià)高的突變菌株制備固體制劑。

1.2.3 突變株U-L-4對(duì)芹菜根腐病病原菌的拮抗作用 芹菜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） J01由前期實(shí)驗(yàn)室分離保存，并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性[11]。用平板對(duì)峙法測(cè)試誘變菌株U-L-4及野生株CT205對(duì)病原菌的拮抗效果。將誘變菌株與野生株、F. oxysporum J01分別接種在PDA平板于28 ℃培養(yǎng)7 d。用無菌打孔器打取直徑5 mm的菌塊，將病原菌菌塊放置在PDA平板中央，以菌塊為中心，在距離菌塊 20 mm 處兩側(cè)對(duì)稱接種生防菌株，并設(shè)置對(duì)照，每處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌株對(duì)病原菌的抑制率。抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑）×100%。

1.2.4 突變株的固體發(fā)酵及生物有機(jī)肥制備 根據(jù)前期固體發(fā)酵條件的優(yōu)化，固體發(fā)酵配方由以下比例組成，細(xì)土與沙 ∶麥麩 ∶花生餅 ∶椰糠 ∶小米 ∶肉骨粉=4 ∶2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1，料水比1 ∶0.8，混合攪拌均勻后，裝袋121 ℃ 30 min滅菌，按10%的接種量接種種子液，分裝淺盤，厚度2.0～2.5 cm，28 ℃ 培養(yǎng)14 d，取樣稀釋涂布測(cè)其活菌數(shù)。細(xì)土：取南京麒麟鎮(zhèn)后村菜園土（黃棕壤）研磨處理，細(xì)土與沙過20目篩，肉骨粉由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院李國(guó)慶教授提供。固體發(fā)酵制備的菌劑，按10%比例復(fù)合有機(jī)肥制備生物有機(jī)肥，有機(jī)肥由淮安柴米禾生物科技公司提供。

1.2.5 田間試驗(yàn) 2019年9—11月，在南京溧水華城蔬菜種植合作社進(jìn)行田間試驗(yàn)。土壤類型為馬肝土，含全氮1.87 g/kg、速效磷172.4 mg/kg、速效鉀155.23 mg/kg、有機(jī)質(zhì)26.77 g/kg，pH值7.18，土壤中尖孢鐮刀菌計(jì)數(shù)為2.3×104 CFU/g。大棚種植前施用普通有機(jī)肥1 500 kg/hm2和三元復(fù)合肥（純N、P2O5、K2O含量均為16%）、尿素（N>46%）、硫酸鉀（K2O>52%）各300 kg/hm2，作基肥，撒施深翻整平、培壟。設(shè)置U-L-4生物有機(jī)肥（108 CFU/g）、木霉生物有機(jī)肥（淮安柴米禾生物科技公司提供，木霉有效活菌數(shù)108 CFU/g）和對(duì)照3個(gè)處理，大棚等面積分9塊，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積2×2 m2。U-L-4生物有機(jī)肥處理減施10%三元復(fù)合肥。

移栽35 d的芹菜苗，株距20 cm，生物有機(jī)肥處理每株穴施10 g。移栽種植后35 d，統(tǒng)計(jì)不同處理芹菜發(fā)病情況，取不同處理1×1 m2芹菜植株連根拔起，統(tǒng)計(jì)生物量，計(jì)算產(chǎn)量。取芹菜根際土，稀釋涂布法測(cè)定土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌以及尖孢鐮刀菌的數(shù)量。尖孢鐮刀菌用Komada選擇性培養(yǎng)基（K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)e-EDTA 0.01 g，天門冬酰胺 2.0 g，D-半乳糖20.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水1 L，pH 值7.2～7.4）計(jì)數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 本研究數(shù)據(jù)利用Microsoft Office Excel 2010、SPSS BASE ver.25.0統(tǒng)計(jì)分析，在α=0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效誘變菌株的篩選

由圖1可見，隨著UV處理時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率不斷增加，1～2 min致死率急劇上升，4～6 min致死率處于90%左右，6 min時(shí)致死率接近100%。

參考UV誘變處理的致死率結(jié)果，選擇0.5、1、2 min 等3個(gè)UV照射劑量，進(jìn)行UV-LiCl復(fù)合誘變處理，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外照射0.5 min后，致死率伴隨LiCl濃度的增加而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而1 min與2 min UV照射與0.1%～0.6%的LiCl誘變結(jié)合致死率無明顯規(guī)律。根據(jù)致死率，選擇在0.5 min UV和0.1% LiCl處理中挑選菌落。

共挑取105個(gè)菌落，通過與酵母菌拮抗試驗(yàn)對(duì)比得到20株正突變菌。5次傳代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)有12株菌株拮抗能力下降。剩余8株菌株依次編號(hào) U-L-1、U-L-2、U-L-3、…、U-L-8，分別測(cè)定2次液體發(fā)酵上清液中環(huán)己酰亞胺的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘變株U-L-2與U-L-4的產(chǎn)量較高，達(dá)到42 mg/L左右，但傳代后菌株U-L-2生長(zhǎng)緩慢、分生孢子不豐富，最終選擇U-L-4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，其活性物質(zhì)產(chǎn)量較野生菌株提高了55.56%（圖2）。

2.2 突變株U-L-4對(duì)病原菌抑制效果

對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，突變株U-L-4與野生型CT205均對(duì)芹菜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果（圖3），與野生型CT205相比，誘變菌株的抑菌能力顯著提高，對(duì)病原菌的抑菌率達(dá)到70.31%（表2），因此后續(xù)利用誘變菌株U-L-4進(jìn)行固體發(fā)酵及對(duì)芹菜根腐病進(jìn)行防控。

2.3 突變菌株U-L-4固體發(fā)酵及生物有機(jī)肥制備

菌株U-L-4種子液按10%接種量接種后 3 d，菌體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，基質(zhì)表面出現(xiàn)白色菌絲體。接種后7 d，基質(zhì)表面的白色變?yōu)榛疑▓D4），基質(zhì)散發(fā)放線菌特有的“土腥味”，鏡檢發(fā)現(xiàn)大量菌絲及少量分生孢子。培養(yǎng)14 d，取樣鏡檢發(fā)現(xiàn)大量分生孢子，然后活菌計(jì)數(shù)，U-L-4固體制劑活菌數(shù)達(dá)8.0×108 CFU/g。按10%比例復(fù)合有機(jī)肥制備生物有機(jī)肥。

2.4 田間試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 不同處理芹菜生物量及產(chǎn)量的差異 結(jié)果表明，施用U-L-4生物有機(jī)肥及木霉生物有機(jī)肥與對(duì)照相比，芹菜的株高、鮮質(zhì)量等生物量顯著增加（圖5、表3）。對(duì)照處理的芹菜發(fā)病率為27.91%，經(jīng)觀察發(fā)病植株根基部出現(xiàn)一定程度的腐爛且有褐黃色水漬。木霉生物有機(jī)肥處理的芹菜發(fā)病率為6.67%，發(fā)病芹菜根基部出現(xiàn)斷口，無明顯水漬。U-L-4生物有機(jī)肥處理植株沒有出現(xiàn)發(fā)病植株。經(jīng)統(tǒng)計(jì)U-L-4生物有機(jī)肥處理和木霉生物有機(jī)肥處理的芹菜產(chǎn)量分別達(dá)到20 979、15 984 kg/hm2，分別比對(duì)照提高了75.00%、33.33%。

2.4.2 不同處理芹菜植株根際主要微生物數(shù)量變化 施用U-L-4生物有機(jī)肥及木霉生物有機(jī)肥處理芹菜根際主要微生物數(shù)量發(fā)生顯著變化（表4）。U-L-4生物有機(jī)肥處理后，根際土中細(xì)菌數(shù)量較木霉及對(duì)照處理顯著降低，放線菌數(shù)量較木霉及對(duì)照處理顯著增加。U-L-4生物有機(jī)肥與木霉生物有機(jī)肥處理根際土壤中真菌的數(shù)量變化差異不顯著，但與對(duì)照相比顯著降低。比較各處理根際土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)U-L-4生物有機(jī)肥及木霉生物有機(jī)肥均能顯著降低尖孢鐮刀菌的數(shù)量，但U-L-4生物有機(jī)肥處理的效果更好，尖孢鐮刀菌的數(shù)量降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，顯著改善了芹菜根際微生物群落組成。

3 討論與結(jié)論

微生物野生菌株效價(jià)低是常見問題，妨礙了功能微生物在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[12]。誘變選育是篩選高效菌株的重要途徑，常規(guī)誘變方法包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變、復(fù)合誘變等[13]，其中復(fù)合誘變是使用2種以上或多次使用1種誘變劑的重要誘變手段，通常誘變劑之間具有協(xié)同作用。如 UV-LiCl 復(fù)合誘變， LiCl本身沒有誘變作用， 但通過協(xié)同作用可以提高UV的誘變效果從而可獲得更為高效的誘變菌株。李蕤等對(duì)木霉T6采用UV-LiCl復(fù)合誘變后獲得一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶能力顯著提升的突變菌株[14]。在對(duì)微生物誘變選育時(shí)要在合適誘變致死率的處理中挑選誘變菌株進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)在70%～80%的誘變致死率中更易出現(xiàn)正突變菌株[15]。本研究采用UV-LiCl復(fù)合誘變?cè)?0%～80%的誘變致死率中篩選獲得1株正突變菌株U-L-4，其抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量較野生型提高了55.56%。

芹菜根腐病病原真菌可以在土壤中存活多年，土傳病害一旦發(fā)生，難以有效防治[16]。土地熏蒸是一種化學(xué)防控措施，使用棉隆消毒劑對(duì)土地熏蒸有一定效果，但是在棉隆熏蒸消毒后，土壤中各類微生物數(shù)量急劇下降，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞[17]。土傳病害的生物防控是促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施，開發(fā)使用生防制劑取代化學(xué)藥劑成為當(dāng)前土傳病害的重要防控手段[18-19]。生防菌株可以通過影響植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)防控病害的發(fā)生[20]。楊可欣等研究發(fā)現(xiàn)，大豆接種芽孢桿菌 8-32 生物制劑處理后，土壤酶活增加，根際微生態(tài)發(fā)生變化，尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著降低，大豆根腐病防控效果顯著[21]。王寧等通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在施用木霉生物制劑制劑后，草莓根際真菌多樣性降低，細(xì)菌多樣性無明顯變化，有害真菌數(shù)量減少，防控草莓土傳病害效果達(dá)到65%[22]。何斐等報(bào)道，魔芋接種放線菌制劑處理后，土傳病害防控效果顯著，根際微生物區(qū)系發(fā)生顯著變化，放線菌數(shù)量增加，有害真菌和細(xì)菌數(shù)量下降，魔芋根際微生物從“真菌型”和“細(xì)菌型”變?yōu)椤胺啪€菌型”[23]。本研究結(jié)果與之相似。目前功能微生物的篩選及生物有機(jī)肥的研發(fā)方興未艾，新型生物有機(jī)肥的應(yīng)用，有利于改良土壤，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，提高農(nóng)業(yè)種植水平和農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)。

本研究利用UV-LiCl復(fù)合誘變得到一株優(yōu)良的突變菌株U-L-4。利用其制備的生物有機(jī)肥可有效防控芹菜根腐病，促進(jìn)芹菜生長(zhǎng)，提高芹菜產(chǎn)量，并顯著降低根際土壤中病原真菌-尖孢鐮刀菌的數(shù)量，改善了根際生態(tài)環(huán)境，芹菜增產(chǎn)75%。

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