肖琦 趙霞玲 錢雯嫻 朱家平 張馮禧 尹力鴻 溫立斌 何孔旺

摘要：為評(píng)價(jià)次氯酸消毒液（以下簡(jiǎn)稱消毒液）對(duì)豬源病原體的消殺作用，以豬場(chǎng)常見的5種病原菌和5種病毒為研究對(duì)象，測(cè)試消毒液在不同濃度和不同作用時(shí)間下的消殺效果。懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，消毒液原液（次氯酸含量為210 mg/L）和1 ∶2倍稀釋消毒液（次氯酸含量為105 mg/L），作用30 s即可殺滅豬鏈球菌2型（SS2）、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）、副豬嗜血桿菌（HPS）、豬丹毒桿菌（ER）和豬大腸桿菌（ETEC）;1 ∶4倍稀釋消毒液（次氯酸含量為52.5 mg/L）作用1 min能殺滅HPS、ER和ETEC，作用5 min能殺滅SS2和APP，殺滅對(duì)數(shù)值均>7.00，殺滅率均為100%。病毒滅活試驗(yàn)結(jié)果表明，消毒液原液作用1 min對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）的平均滅活對(duì)數(shù)值均≥5.00，殺滅率均≥99.999%;1 ∶2倍稀釋消毒液作用1 min對(duì)PEDV的平均滅活對(duì)數(shù)值為4.00、殺滅率為99.990%;消毒液原液作用5 min和10 min，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的殺滅率為99.899%，對(duì)豬偽狂犬病病毒（PRV）的殺滅率為92.921%，對(duì)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的殺滅率為90.00%。表明次氯酸消毒液在推薦濃度下對(duì)豬場(chǎng)常見病原菌有快速高效的消殺效果，對(duì)PEDV和PPV等病毒亦有良好的消殺作用。

關(guān)鍵詞：次氯酸;豬;細(xì)菌;病毒;消毒

中圖分類號(hào)：S855.99 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）21-0170-04

收稿日期：2021-05-15

基金項(xiàng)目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（生豬）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（編號(hào)：JATS[2020]382）;江蘇省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃（編號(hào)：2019-SJ-009-04-01）。

作者簡(jiǎn)介：肖 琦（1980—），女，遼寧丹東人，博士，助理研究員，主要從事豬病與人獸共患病防控研究。E-mail：xiaoqi_2122@163.com。

通信作者：何孔旺，碩士，研究員，主要從事豬病與人獸共患病防控研究。E-mail：kwh2003@263.net。

消毒是豬場(chǎng)重要的生物安全措施之一。豬場(chǎng)常用的消毒方法有物理消毒法、化學(xué)消毒法和生物消毒法等，其中化學(xué)消毒法最為常用[1]。化學(xué)消毒劑的正確選擇和使用是決定豬場(chǎng)消毒效果的關(guān)鍵。含氯類消毒劑是一種高效消毒劑，對(duì)細(xì)菌和病毒有強(qiáng)大的殺滅作用[2]。臨床常用的含氯消毒劑包括次氯酸鈉（如84消毒液）、次氯酸鈣（漂白粉）、二氯異氰尿酸鈉、三氯異氰尿酸鈉等[3]。次氯酸消毒液是一種新型的含氯消毒劑，不僅具有廣譜抗菌、殺菌效率高的特點(diǎn)，而且具有腐蝕性小、極少刺激性氣味、高安全性、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，有望替代刺激性較強(qiáng)的次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉等傳統(tǒng)含氯消毒劑。高曉東等使用次氯酸消毒液對(duì)社區(qū)及醫(yī)院內(nèi)皮膚軟組織感染的病原體殺滅率進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌、分枝桿菌和厭氧菌均能達(dá)到7個(gè)lg值的殺滅率[6]。劉文等在規(guī)?；i舍內(nèi)用次氯酸消毒液（微酸性電解水，有效氯濃度為90 mg/L）噴霧消毒，可有效減少空氣中金黃色葡萄球菌的數(shù)量，消毒后的豬舍內(nèi)空氣微生物在3 d內(nèi)能維持較低的水平[7]。但目前次氯酸消毒液在豬場(chǎng)的使用還不廣泛，也缺乏次氯酸消毒液對(duì)豬源病原菌和病毒殺滅效果的相關(guān)研究。本試驗(yàn)以次氯酸含量為210 mg/L的消毒液為研究對(duì)象，在試驗(yàn)條件下研究其對(duì)豬場(chǎng)常見的豬鏈球菌2型（SS2）、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型（APP5）、副豬嗜血桿菌4型（HPS4）、豬丹毒桿菌（ER）、豬大腸桿菌（ETEC）等5種病原菌和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等5種病毒的殺滅作用，為豬場(chǎng)消毒劑的選擇和使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 次氯酸消毒液

易凱歐次氯酸消毒液（以下簡(jiǎn)稱消毒液）由鶴鳴（上海）環(huán)境科技有限公司生產(chǎn)并提供，生產(chǎn)日期為2020年9月6日，次氯酸含量為210 mg/L，pH值為6.2。

1.2 菌株、毒株及細(xì)胞

豬鏈球菌2型ZY05株（SS2 ZY05株）、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型KL株（APP5 KL株）、副豬嗜血桿菌4型JS株（HPS4 JS株）、豬丹毒桿菌ES株（ER ES株）、豬大腸桿菌O139株（ETEC O139株）、豬圓環(huán)病毒2型P58株（PCV2 P58株）、豬偽狂犬病毒B株（PRV B株）、豬流行性腹瀉病毒JS2012株（PEDV JS2012株）、豬細(xì)小病毒BJ株（PPV BJ株）以及PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗毒GDr180株（PRRSV GDr180株）由廣東永順生物制藥股份有限公司提供。

1.3 主要試劑

Todd Hewitt肉湯（THB）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，THB培養(yǎng)基、THB+0.01%NAD培養(yǎng)基、THB+0.01%NAD+5%小牛血清培養(yǎng)基、THB+5%小牛血清培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基按照配方配制;高糖DMEM培養(yǎng)液、胰酶購(gòu)自Gibico公司;新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司;Champagne Taq DNA Polymerase、2×AceQ qPCR Probe Master Mix、Green Taq Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;Premix Ex Taq（Probe qPCR）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;HiPure Total RNA Mini Kit 總RNA小提試劑盒（雙柱型）、HiPure Universal DNA Kit 通用型DNA抽提試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司;硫代硫酸鈉購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，用無(wú)菌ddH2O將硫代硫酸鈉配制成終濃度為10.5%的中和劑原液，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，備用。

1.4 懸液定量殺菌試驗(yàn)

試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，所有液體使用前恢復(fù)至室溫。參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.4.1 菌種復(fù)蘇 取50 μL凍存菌液，接種到 5 mL 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)。

1.4.2 試驗(yàn)組 每種受試菌共設(shè)9個(gè)消毒液+菌懸液的試驗(yàn)組。1～3組為消毒液原液，4～6組為用無(wú)菌ddH2O進(jìn)行1 ∶2倍稀釋的消毒液，7～9組為用無(wú)菌ddH2O進(jìn)行1 ∶4倍稀釋的消毒液，每組取消毒液4.5 mL，加入0.5 mL菌液，在混勻儀上混勻，作用一定時(shí)間后（1、4、7組作用30 s，2、5、8組作用1 min，3、6、9組作用5 min），加入250 μL中和劑原液，使中和劑的終濃度為0.5%，混勻，作用 10 min 后，菌液計(jì)數(shù)。

1.4.3 對(duì)照組 共設(shè)4個(gè)對(duì)照組。稀釋液+菌懸液對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照）：取無(wú)菌ddH2O 4.5 mL，加入0.5 mL菌液，作用5 min后，加入250 μL無(wú)菌ddH2O，作用10 min后，菌液計(jì)數(shù)。

中和劑+菌懸液對(duì)照組：取無(wú)菌ddH2O 4.5 mL，加入0.5 mL菌液，作用5 min后，加入 250 μL 中和劑原液，混勻，作用10 min后，菌液計(jì)數(shù)。

（消毒液+中和劑）+菌懸液對(duì)照組：取消毒液原液4.5 mL，加入0.5 mL無(wú)菌ddH2O，加入250 μL中和劑原液，混勻，作用10 min后，加入0.5 mL菌懸液，作用5 min后，菌液計(jì)數(shù)。

稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基對(duì)照組（陰性對(duì)照）：取無(wú)菌ddH2O 4.5 mL，加入0.5 mL培養(yǎng)基，加入250 μL中和劑原液，作用10 min后，菌液計(jì)數(shù)。

1.5 病毒滅活試驗(yàn)

試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，所有液體使用前恢復(fù)至室溫。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.5.1 病毒培養(yǎng) 將PCV2、PRV、PEDV、PPV、PRRSV毒株分別在PK15細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞、PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞上培養(yǎng)，并測(cè)定各毒株的TCID50。

1.5.2 試驗(yàn)組 每種病毒共設(shè)9個(gè)試驗(yàn)組。1～3組使用消毒液原液，4～6組使用用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行1 ∶2倍稀釋的消毒液，7～9組使用用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行1 ∶4倍稀釋的消毒液，每組取消毒液40 μL，加入40 μL病毒原液，在混勻儀上混勻，作用一定的時(shí)間后（1、4、7組作用1 min，2、5、8組作用5 min，3、6、9組作用 10 min），迅速加入9倍體積（720 μL）病毒培養(yǎng)液，作為10-1稀釋組，然后用病毒培養(yǎng)液依次做10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個(gè)孔，每孔150 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，測(cè)TCID50。

1.5.3 對(duì)照組 共設(shè)3個(gè)對(duì)照組。

病毒對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照）：取40 μL病毒培養(yǎng)液，加入40 μL病毒原液，加入9倍體積（720 μL）病毒培養(yǎng)液，作為10-1稀釋組，然后用病毒培養(yǎng)液依次做10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個(gè)孔，每孔150 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，測(cè)TCID50。

消毒液對(duì)照組：取消毒液原液40 μL，加入 40 μL 病毒培養(yǎng)液，加入9倍體積（720 μL）病毒培養(yǎng)液，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個(gè)孔，每孔 150 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

空白細(xì)胞對(duì)照組（陰性對(duì)照）：驗(yàn)證不接毒細(xì)胞是否可以正常生長(zhǎng)。未接種病毒的細(xì)胞，在含有2%小牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸液定量殺菌試驗(yàn)

由表1可見，消毒液原液（次氯酸含量為 210 mg/L）和1 ∶2倍稀釋消毒液（次氯酸含量為 105 mg/L），作用30 s、1 min、5 min，對(duì)SS2 ZY05株、APP5 KL株、HPS4 JS株、ER ES株和ETEC O139株的殺滅對(duì)數(shù)值均>7.00，殺滅率均為100%;1 ∶4倍稀釋消毒液（次氯酸含量為52.5 mg/L）作用 1 min 對(duì)HPS4 JS株、ER ES株和ETEC O139株，作用 5 min 對(duì)SS2ZY05株和APP5 KL株，殺滅對(duì)數(shù)值亦均>7.00，殺滅率均為100%。

2.2 病毒滅活試驗(yàn)

由表2可見，消毒液原液（次氯酸含量為 210 mg/L）與病毒液作用1、5、10 min對(duì)PEDV JS2012株和PPV BJ株的平均滅活對(duì)數(shù)值均≥5.0、殺滅率≥99.999%;1 ∶2倍稀釋的消毒液（次氯酸含量為105 mg/L）作用5 min和10 min、1 ∶4 倍稀釋的消毒液（次氯酸含量為52.5 mg/L）作用10 min對(duì)PEDV JS2012株的平均滅活對(duì)數(shù)值亦均為5.00、殺滅率為99.999%;1 ∶2倍稀釋的消毒液作用 1 min 對(duì)PEDV JS2012株的平均滅活對(duì)數(shù)值為4.00、殺滅率為99.990%。而消毒液原液作用 5 min 和10 min對(duì)PRRSV GDr180株的平均滅活對(duì)數(shù)值為3.00，殺滅率為99.899%;對(duì)PRV B株的平均滅活對(duì)數(shù)值為1.15，殺滅率為92.921%;對(duì)PCV2 P58株的平均滅活對(duì)數(shù)值為1.00，殺滅率為90.00%。

3 討論

豬場(chǎng)常用的化學(xué)消毒劑主要有堿類消毒劑、含氯消毒劑、含碘消毒劑、季銨鹽類消毒劑、醛類消毒劑、過(guò)氧化物類消毒劑、酚類消毒劑、醇類消毒劑等[1]。其中，含氯消毒劑是指以次氯酸（有效氯）為主要?dú)⒕煞值囊活愊緞?，主要包括次氯酸鈉、次氯酸鈣、 液氯、二氯異氰脲酸鈉、三氯異氰脲酸和次氯酸等[3]。次氯酸消殺病原微生物的作用原理主要包括：對(duì)微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜造成一定程度的破壞;破壞細(xì)胞內(nèi)存在的大量蛋白類物質(zhì)，同時(shí)，也可對(duì)細(xì)胞核中的核苷酸造成破壞;通過(guò)破壞微生物的電子傳遞鏈及各種代謝中的關(guān)鍵酶， 對(duì)微生物的代謝造成嚴(yán)重的影響;次氯酸與微生物反應(yīng)后可生成活性氧物質(zhì)、氯胺，這些物質(zhì)同樣可對(duì)微生物造成殺滅作用[10]。但由于次氯酸鈉、二氯異氰脲酸鈉等傳統(tǒng)含氯消毒劑均具有較強(qiáng)的刺激性和腐蝕性，對(duì)消毒對(duì)象有一定的毒性，從而限制了含氯消毒劑的臨床廣泛應(yīng)用。因此，一種新型的含氯消毒劑——次氯酸消毒劑應(yīng)運(yùn)而生。次氯酸消毒劑又叫弱酸性次氯酸水或微酸性次氯酸水，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《含氯消毒劑衛(wèi)生要求》中明確次氯酸消毒劑的定義為“消毒液原液中含有穩(wěn)定的次氯酸的消毒劑”[11]，它可以廣譜抵抗微生物，在有效的抗菌濃度范圍內(nèi)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)刺激性、無(wú)致敏、細(xì)胞毒性較低，而且環(huán)境友好[4]。而易凱歐次氯酸消毒液就是一種次氯酸消毒劑。

一種消毒劑的殺滅效果，通常以殺滅對(duì)數(shù)值或殺滅率來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)，殺滅對(duì)數(shù)值是指當(dāng)微生物的數(shù)量以對(duì)數(shù)表示時(shí)，消毒前后微生物減少的對(duì)數(shù)值;而殺滅率是指在微生物殺滅試驗(yàn)中，用百分率表示微生物數(shù)量減少的值。一種消毒劑在懸液定量殺菌試驗(yàn)中，細(xì)菌各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥5.00，相當(dāng)于傳染性喪失程度為99.999%時(shí)，可判定該消毒劑對(duì)細(xì)菌消毒合格;而病毒消殺試驗(yàn)中，病毒各次試驗(yàn)的平均滅活對(duì)數(shù)值≥4.00時(shí)，相當(dāng)于傳染性喪失程度為99.99%時(shí)，可判定該消毒劑對(duì)病毒消毒合格。而殺滅率為99.9%、99%、和90%時(shí)，則表明消毒劑的消殺能力依次降低[8，12]。而殺滅率低于90%時(shí)則表明該消毒劑消殺病原微生物能力很低，不能用于臨床消毒。本研究中，易凱歐次氯酸消毒液在次氯酸含量為105 mg/L時(shí)，能在30 s內(nèi)高效殺滅所試5種常見豬源病原菌，殺滅對(duì)數(shù)值均≥7.00，而當(dāng)次氯酸含量為52.5 mg/L時(shí)，延長(zhǎng)作用時(shí)間至1～5 min亦能高效殺滅常見豬源病原菌;而對(duì)5種豬源病毒，易凱歐次氯酸消毒液的滅活效果卻存在一定的差異，次氯酸含量為210 mg/L時(shí)消毒液可快速高效滅活PEDV和PPV，平均滅活對(duì)數(shù)值亦≥5.0;而對(duì)PRRSV、PRV和PCV2則表現(xiàn)為中效或低效滅活作用。表明次氯酸消毒液在推薦濃度下對(duì)豬場(chǎng)常見病原菌有快速高效的殺滅效果，對(duì)PEDV和PPV等病毒亦有良好的消殺作用，可用于豬場(chǎng)日常消毒。

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