王建茹，李 彬，王新陸，彭廣操，趙齊飛，于 瑞，王永霞，朱明軍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000)

胞葬作用(Efferocytosis)是指胞葬細胞將死亡細胞及時清除的過程[1，2]。人體內(nèi)每天都有數(shù)十億細胞發(fā)生死亡，死亡細胞與胞葬細胞通過不同信號傳導(dǎo)，促進其被及時有效的清除，介導(dǎo)各種不同的病理生理結(jié)果[3]。胞葬作用介導(dǎo)多種系統(tǒng)疾病的病理過程，在維持組織穩(wěn)態(tài)、組織修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用，已成為近幾年治療疾病的潛在性干預(yù)靶點和新的研究方向[3，4]。

中藥及其復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑和多效應(yīng)的特點，在治療疾病方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[5]。研究報道，具有益氣活血祛痰功效的中藥復(fù)方冠心康可改善動脈粥樣硬化病理過程中受損的巨噬細胞胞葬作用，其機制可能與其上調(diào)胞葬作用相關(guān)信號分子的表達有關(guān)。這提示中藥通過干預(yù)胞葬作用治療疾病具有廣闊的應(yīng)用前景[6]，但目前這方面的相關(guān)研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性和系統(tǒng)性等特點，分子對接技術(shù)是預(yù)測受體分子與配體化合物結(jié)合模式和親合力的方法，兩者聯(lián)合已被廣泛用于闡釋中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機制的研究中[7-9]。

本研究以胞葬作用這一熱門表型為切入點，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，系統(tǒng)預(yù)測胞葬作用相關(guān)靶點、活性成分和中藥三者之間的復(fù)雜對應(yīng)關(guān)系，同時挖掘中藥性味歸經(jīng)的分布情況，初步探討中藥調(diào)控胞葬作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及一般用藥規(guī)律，以期為后續(xù)治療胞葬作用功能障礙相關(guān)疾病、藥物的研發(fā)以及中醫(yī)藥現(xiàn)代化等方面的研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

首先從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲取胞葬作用相關(guān)靶點。其次在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫中，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥18%為條件，篩選出作用于胞葬作用相關(guān)靶點的活性成分，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫中匹配出包含這些活性成分的中藥，然后再利用Autodock Vina軟件進行分子對接，以驗證中藥活性成分與胞葬作用相關(guān)靶點之間映射結(jié)果的科學(xué)性和可信性；同時，利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)、表型-靶點-成分-中藥網(wǎng)絡(luò)進行可視化，并采用軟件中的Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點。最后在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺V2.0、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫、中國醫(yī)藥信息查詢平臺中收集已匹配出的中藥性味歸經(jīng)信息，統(tǒng)計分析其出現(xiàn)的頻次和頻率，并對中藥用藥規(guī)律進行分析，具體步驟見圖1。

圖1 研究思路圖

1.1 收集胞葬作用相關(guān)作用靶點

為獲取與胞葬作用相關(guān)的作用靶點，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中以“efferocytosis”為檢索詞進行檢索。由于不同數(shù)據(jù)庫基因代號不統(tǒng)一，需通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對所有作用靶點名稱進行標(biāo)準化。

1.2 篩選中藥的活性成分

TCMSP是一種獨特的從系統(tǒng)水平研究中藥作用機理的平臺，包含499味草藥以及每味草藥的化合物成分(共計29000余個)，針對每個化合物提供了較全面的人體吸收、分布、代謝等藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，同時也提供了潛在活性分子靶標(biāo)及其疾病信息，形成了針對每位草藥的藥物-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)。將1.1獲得的胞葬作用相關(guān)靶點輸入到TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中，以O(shè)B≥30%、DL≥18%為條件，篩選中藥的活性成分。

1.3 構(gòu)建中藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

將1.1獲得的胞葬作用相關(guān)靶點和1.2獲得的中藥活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，將兩者的映射關(guān)系進行可視化，然后利用Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，識別關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點。

1.4 活性成分-胞葬作用相關(guān)靶點分子對接

為驗證預(yù)測的胞葬作用潛在作用靶點與中藥活性成分之間相互作用關(guān)系的可信度，將胞葬作用潛在作用靶點與其所對應(yīng)的活性成分進行分子對接。首先，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB，http://www.rcsb.org/pdb/)中檢索人源胞葬作用相關(guān)靶點的PDB ID號，用PyMOL軟件去除水分子和配體等，Auto dock Tools軟件加氫然后轉(zhuǎn)換成pdbqt格式。其次，從PubChem數(shù)據(jù)庫 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載中藥活性成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式，再用ChemBio3D進行優(yōu)化，保存為mol2格式。最后，利用Autodock Vina軟件進行分子對接，獲取結(jié)合能值，對接結(jié)果采用Discovery Studio Visualizer 4.5和PyMOL軟件進行可視化。結(jié)合能數(shù)值為負則提示活性成分與作用靶點可自由結(jié)合，數(shù)值越小說明對接體系越穩(wěn)定，對接結(jié)果越可靠。本研究設(shè)定自由結(jié)合能小于-5 kcal/mol代表結(jié)合具有顯著性，說明活性成分與靶點之間作用關(guān)系可信度高。

1.5 構(gòu)建“表型-靶點-成分-中藥網(wǎng)絡(luò)圖”

在excel表中分別構(gòu)建“中藥-活性成分”“活性成分-靶點”“靶點-表型”文件，并將這些文件輸入到Cytoscape3.7.2軟件中，利用Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)分析，篩選出關(guān)鍵節(jié)點，并構(gòu)建“表型-靶點-成分-中藥網(wǎng)絡(luò)圖”進行可視化。最后，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點拓撲學(xué)參數(shù)信息，初步評價中藥及其活性成分調(diào)控胞葬作用的功效強度。

1.6 中藥獲取及其數(shù)據(jù)整理分析

為獲取具有調(diào)控胞葬作用的中藥，將1.2中獲取的具有調(diào)控胞葬作用的中藥活性成分輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集匹配的中藥。為分析具有調(diào)控胞葬作用中藥的用藥規(guī)律，將匹配出的中藥再輸入到中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺V2.0(http:∥www.tcmip.cn/)、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http:∥www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)、中國醫(yī)藥信息查詢平臺(https:∥www.dayi.org.cn/)中收集這些中藥的性味歸經(jīng)信息，并統(tǒng)計分析各個中藥性味歸經(jīng)出現(xiàn)的頻次和頻率。若中藥的性味歸經(jīng)不止1個，則要全部如實記錄。出現(xiàn)頻率=出現(xiàn)頻次/總頻次×100%。

2 結(jié)果

2.1 胞葬作用相關(guān)靶點的篩選

從Gene Cards數(shù)據(jù)庫中共檢索到與胞葬作用相關(guān)的靶點73個，其中41個靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中沒有收錄，8個靶點雖有收錄但無匹配的化合物，24個靶點檢索到匹配的化合物。以O(shè)B≥30%、DL≥18%為條件，對24個靶點匹配的化合物進行篩選，結(jié)果10個靶點的化合物不符合標(biāo)準，其余14個靶點匹配的化合物符合，這14個靶點即為胞葬作用的潛在靶點，在胞葬作用的過程中充當(dāng)不同角色，并發(fā)揮著不同的功能(見表1)。

表1 胞葬作用的潛在靶點信息

2.2 中藥活性成分的獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B≥30%、DL≥18%，并能匹配胞葬作用的潛在靶點為條件對中藥的活性成分進行篩選，結(jié)果共獲得24個活性成分(見表2)。將24個活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中分別匹配中藥，匯總剔除重復(fù)中藥后共獲得368種藥物。368味中藥所包含活性成分的數(shù)量在1～12個之間，其中含有1個活性成分的中藥最多達102味，其次是含有6個活性成分的中藥共72味；另外，含有12個活性成分的中藥有2味分別為半枝蓮和木蝴蝶，有1味中藥(白果)含有11個活性成分(見圖2)。

圖2 預(yù)測中藥所包含活性成分分布情況比較

表2 中藥活性成分信息比較

2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖由38個節(jié)點、78條邊組成，度值范圍為1～12，平均度值為2.053；網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點代表活性成分或靶點，邊表示節(jié)點間的作用或?qū)?yīng)關(guān)系，度值表示與該節(jié)點直接相互作用節(jié)點的數(shù)目，度值越大說明該節(jié)點的樞紐性越強，在整個網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用越大，生物學(xué)功能的重要性越強。

圖3中的藍色圓形節(jié)點代表中藥活性成分，紅色六邊形節(jié)點代表胞葬作用潛在靶點；其中度值排名前8位的活性成分分別關(guān)聯(lián)2個以上的靶點；度值排名前7位的靶點分別映射2個以上的中藥活性成分。結(jié)果提示，這些活性成分和靶點較重要，可對其進一步開展深入研究。

圖3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 分子對接結(jié)果

結(jié)果表明，提取出的39對“活性成分-作用靶點”關(guān)系對中，胞葬作用潛在靶點與中藥相關(guān)活性成分均存在不同程度的結(jié)合，結(jié)合自由能均小于-5 kcal/mol，說明預(yù)測結(jié)果具有一定的科學(xué)性和可靠性(見表3)。結(jié)合自由能≤ -9.5 kcal/mol的3對關(guān)系對的分子對接結(jié)果示意圖，顯示活性成分與胞葬作用潛在靶點之間具有良好的親和力，兩者大多以氫鍵的形式相互作用(圖4)。

表3 活性成分與胞葬作用相關(guān)靶點分子對接信息比較

注：A.Baicalein-ALOX12；B.Triptolide-CD274；C.Quercetin-NFE2L2;A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2為對接空間位置的3D立體圖；A-3、B-3、C-3為對接作用的2D平面圖圖4 活性成分與靶蛋白分子對接結(jié)果示意圖(結(jié)合自由能 ≤ -9.5 kcal/mol)

2.5 “表型-靶點-成分-中藥網(wǎng)絡(luò)圖”的構(gòu)建

根據(jù)預(yù)測的中藥與其所含有的活性成分以及胞葬作用潛在靶點的對應(yīng)關(guān)系，初步構(gòu)建“表型-靶點-成分-中藥網(wǎng)絡(luò)圖”，該網(wǎng)絡(luò)中共含407個節(jié)點，1594條邊，度值范圍為1～7，平均度值為3.916。度值排名前3的中藥共12味占比3.26%，這些藥物除黃芩、雞血藤外，其余10味中藥所關(guān)聯(lián)的胞葬作用潛在靶點均在9個以上(見圖5、6)，結(jié)果表明半枝蓮、木蝴蝶、苦參、白果、葛花、紅花、黃柏、麻黃、牛膝、山豆根這10味中藥在干預(yù)胞葬作用方面具有較大的潛在調(diào)控作用。本研究選取度值≥4的中藥及其所關(guān)聯(lián)的活性成分、胞葬作用潛在靶點重新構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，以便直觀地展示胞葬作用潛在靶點、活性成分、中藥之間的對應(yīng)關(guān)系(如圖7)，紅色菱形節(jié)點代表胞葬作用這一表型，紫色V節(jié)點代表與胞葬作用相關(guān)的潛在靶點，綠色三角形節(jié)點代表預(yù)測的能調(diào)控胞葬作用的活性成分，黃色圓形節(jié)點代表預(yù)測的具有調(diào)控胞葬作用的中藥。

圖5 預(yù)測中藥度值的分布情況

圖6 預(yù)測中藥對應(yīng)胞葬作用相關(guān)靶點的分布情況

圖7 表型-靶點-成分-中藥網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 中藥性味歸經(jīng)的分布情況

368味中藥性微溫者有3味，微寒者12味，均按性溫、性寒記錄；藥味微酸者2味，微甘者1味，微辛者3味，微苦者10味，均按味甘、味辛、味苦記錄；有9味藥物未收集到歸經(jīng)信息。對中藥的性味歸經(jīng)頻次進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)藥味總頻次為587次，藥性總頻次為368次，歸經(jīng)總頻次為835次。具有調(diào)控胞葬作用的中藥在藥味方面以味苦的出現(xiàn)頻次和頻率最高，其次為味辛和味甘；在藥性方面，以性寒的出現(xiàn)頻次和頻率最高，其次為性溫和性平；在歸經(jīng)方面，以肝經(jīng)的出現(xiàn)頻次和頻率最高，其次為肺經(jīng)、胃經(jīng)(見表4圖8)。

圖8 中藥的歸經(jīng)分布

表4 中藥的性味分布

3 討論

胞葬作用由專職的和非專職的吞噬細胞(即胞葬細胞)完成，其中主要的細胞類型為巨噬細胞，胞葬細胞與死亡細胞通過它們表面的食我信號和尋我信號，以“配體-受體”的直接結(jié)合形式和“配體-調(diào)理素-受體”的間接結(jié)合形式，完成對死亡細胞的識別、捕獲、降解過程，從而抑制促炎因子和毒性分子的釋放，促進抗炎因子的釋放；同時，非食我信號分子可負性調(diào)控以上2種結(jié)合形式[10]。此外，胞葬過程還受一些非胞葬作用相關(guān)信號分子的調(diào)控[11]。本研究預(yù)測的14個胞葬作用潛在靶點中，大多為非胞葬作用相關(guān)信號分子和食我信號分子，這些靶點中白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1 beta，IL1B)、尿激酶型纖溶酶原激活物受體(plasminogen activator urokinase receptor，PLAUR)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)、核轉(zhuǎn)錄NR-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NFE2L2)、白細胞分化抗原274(cluster of differentiation 274，CD274)的功能作用較重要，值得進一步深入研究。由于檢索數(shù)據(jù)庫的不完善，一些已經(jīng)被證實的介導(dǎo)胞葬過程的信號分子未被篩選出來，如Mer受體酪氨酸激酶(mer tyrosine kinase，MerTK)、T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域含4(t cell immunoglobulin and mucin domain containing 4,TIMD4)、乳脂球-表皮生長因子8蛋白(milk fat globule-EGF factor 8 protein,MFGE8)、白細胞分化抗原47(cluster of differentiation 47，CD47)等。

活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)顯示，具有調(diào)控胞葬作用潛在靶點的24個中藥活性成分大多屬于黃酮類化合物、生物堿和萜類化合物，其中槲皮素(quercetin)、雷公藤甲素(triptolide)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、漢黃芩素(wogonin)、非瑟酮(fisetin)、芍藥苷(paeoniflorin)、胡椒堿(piperine)、青藤堿(sinomenine)在調(diào)控胞葬作用方面表現(xiàn)出明顯的潛力，成為調(diào)節(jié)劑的可能性較大。研究顯示，這8個活性成分均具有調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用[12-18]，除了青藤堿外其余7個活性成分還可調(diào)控巨噬細胞的吞噬作用[18-23]，說明這些活性成分的功能作用與胞葬的作用機制相吻合，驗證了本研究的預(yù)測結(jié)果。同時值得注意的是，網(wǎng)絡(luò)中另一個活性成分花生四烯酸(arachidonic acid)，其度值雖小，但已被證明是一個具有胞葬作用的抑制劑，它可通過活化Rho誘導(dǎo)細胞形態(tài)變化，從而抑制巨噬細胞的胞葬作用[24]。此外，網(wǎng)絡(luò)中多種活性成分如槲皮素、胡椒堿等在植物類食品中也被發(fā)現(xiàn)，提示本研究所預(yù)測的結(jié)果可為胞葬作用功能障礙相關(guān)疾病的食療提供一定的研究思路與依據(jù)。

分子對接技術(shù)可快速有效地預(yù)測指定蛋白與配體之間的結(jié)合模式和結(jié)合自由能，進而指導(dǎo)研究者對其功能及作用機制進行深入探索研究[25，26]。本研究分子對接的結(jié)果顯示，39對“活性成分-作用靶點”關(guān)系對的結(jié)合自由能均小于-5.0 kcal/mol，這提示中藥活性成分與胞葬作用潛在靶點之間具有良好的結(jié)合力；其中Baicalein-ALOX12、Triptolide-CD274、Quercetin-NFE2L2的結(jié)合自由能均小于-9.5 kcal/mol，這3對關(guān)系對相互之間大多以氫鍵的形式結(jié)合，表現(xiàn)出最強的結(jié)合能力，具有深入開發(fā)研究的價值。研究顯示，黃芩素(Baicalein)為ALOX12的天然選擇性抑制劑[27]，雷公藤甲素(triptolide)能負性調(diào)控CD274的表達[28]，槲皮素(quercetin)可正性調(diào)控NFE2L2的表達[29]。這些研究進一步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的“活性成分-作用靶點”關(guān)系對的可靠性。

在中藥篩選方面，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測共有368味中藥與胞葬作用相關(guān)聯(lián)，其中半枝蓮、木蝴蝶、苦參、白果、葛花、紅花、黃柏、麻黃、牛膝、山豆根的度值均在5以上，其所關(guān)聯(lián)的胞葬作用潛在靶點均在9個以上，提示這10味中藥在調(diào)控胞葬作用方面表現(xiàn)出較大的潛力，尤以半枝蓮最為重要。頻次頻率分析結(jié)果顯示，與胞葬作用相關(guān)的中藥大都歸肝經(jīng)、肺經(jīng)，藥味多為苦、辛，藥性以寒、溫為主，這提示胞葬作用的機制與中醫(yī)肝經(jīng)、肺經(jīng)、味苦、味辛、性寒、性溫的關(guān)系密切相關(guān)。中醫(yī)陰陽五行學(xué)說認為，肺屬金，金曰從革，有沉降、肅殺、收斂等性質(zhì)或作用，為陽中之陰；肝屬木，木曰曲直，有生長、升發(fā)、條達、舒暢等性質(zhì)或作用，為陰中之陽。這一理論認識與頻次頻率分析的與胞葬作用相關(guān)聯(lián)的368味中藥性味歸經(jīng)規(guī)律結(jié)果不謀而合。此外，中醫(yī)學(xué)認為肝藏血主疏泄，肺朝百脈主治節(jié)，兩者的相互作用關(guān)系集中體現(xiàn)在調(diào)控全身氣機升降和氣血運行方面，因此胞葬作用功能障礙的中醫(yī)病機可能為氣機不暢、氣血失和，遣方用藥時需注重調(diào)暢氣機、調(diào)和氣血。

綜上所述，本研究以胞葬作用這一方興未艾的疾病表型為切入點，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接、數(shù)據(jù)挖掘方法，較為系統(tǒng)地探討了中藥干預(yù)胞葬作用潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其用藥規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與調(diào)控胞葬作用相關(guān)的中藥大多歸肝經(jīng)、肺經(jīng)，性味多為寒、溫、苦、辛，中藥活性成分多屬于黃酮類化合物、生物堿和萜類化合物。本研究結(jié)果在一定程度上可為中醫(yī)臨床遣方用藥治療胞葬作用功能障礙相關(guān)疾病以及進一步開展探索性實驗研究提供了借鑒，助力中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究。由于分子對接等信息技術(shù)的不全面以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所采用的數(shù)據(jù)庫未能實時更新，可能會導(dǎo)致研究預(yù)測結(jié)果的客觀性、精準性與實際情況出現(xiàn)偏頗；此外，本文尚未兼顧中藥炮制、煎煮等處理對中藥所含化合物之間相互作用的影響。因此，本研究在一定程度上具有一定的局限性，其結(jié)果仍需后續(xù)基礎(chǔ)實驗和臨床試驗研究的進一步觀察與佐證。