李建中，徐德宇，周 玲，沈 蕾，盧國(guó)元

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 蘇州 215006

腹膜透析是終末期腎臟病患者（end?stage renal disease，ESRD）一種有效的腎臟替代治療方式，并且其具有不受時(shí)間、地點(diǎn)限制的特點(diǎn)，中國(guó)腹膜透析人群的數(shù)量在近年呈爆發(fā)式增長(zhǎng)［1-3］。但是隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)，腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率增高伴隨腹膜超濾功能衰竭，是患者退出腹透的主要原因［4］。目前臨床主要利用腹膜平衡試驗(yàn)（peritoneal equilibra?tion test，PET）觀察腹膜超濾及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)評(píng)估腹膜功能，主要包括3 個(gè)指標(biāo)：4 h 腹透液與血液肌酐比值（D/P Cr）、4 h 與0 h 腹透葡萄糖濃度比值（D/D0）以及4 h 超濾量，D/P Cr、D/D0與全因死亡率及住院率呈線(xiàn)性相關(guān)［5］。目前研究表明腹透患者長(zhǎng)期的腹腔微炎癥狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，是引起腹膜功能減退的重要因素，而腹膜局部能夠產(chǎn)生炎癥因子，包括白介素（interleukin，IL）?6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）?α，可以反映腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率，可能是判斷腹膜功能的生物標(biāo)志物［6-7］。

IL?1家族由各類(lèi)單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)控生物體固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，IL?36是IL?1家族的重要組成成分，包括IL?36α、IL?36β、IL?36γ，其與特異性受體IL?36R結(jié)合后能夠與IL?1R 附屬蛋白形成異源二聚體，激活下游炎癥信號(hào)［8］。目前研究表明IL?36 參與多種自身免疫性疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病等［9-10］。但是腹腔IL?36 水平是否能夠反映腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能尚未有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)腹透患者腹透流出液IL?36水平，與患者PET試驗(yàn)結(jié)果相比較，分析透出液IL?36 水平與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性的相關(guān)性，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，旨在尋找反映腹膜功能的新的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

2018 年6 月—2019 年12 月于蘇州大學(xué)腹膜透析中心定期行PET 試驗(yàn)評(píng)估的持續(xù)不臥床腹膜透析（continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD）的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：近6個(gè)月患有腹膜炎、受過(guò)腹部創(chuàng)傷或者其他急性炎癥；近6 個(gè)月有激素或免疫抑制劑使用史；患有結(jié)締組織疾病、惡性腫瘤；臨床資料不完整。最終，111例患者納入了該項(xiàng)研究，所有受試者均簽署知情同意書(shū)并經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)采集及隨訪(fǎng)

收集入選患者的基本人口學(xué)資料，包括性別、年齡、是否患有糖尿病、是否患有高血壓、是否患有心血管疾病（包括心力衰竭、急性心肌梗死、心律失常、心搏驟停、腦血管意外等）以及基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)，包括血白蛋白、血磷、血鈣、血紅蛋白等，并收集隨訪(fǎng)17 個(gè)月時(shí)死亡、轉(zhuǎn)為血液透析、新發(fā)心血管疾病等資料。所有患者在行PET 前1 夜均行標(biāo)準(zhǔn)CAPD治療，透析液留腹過(guò)夜，詳細(xì)記錄留腹時(shí)間及過(guò)夜流出液總量，次日早晨留取10 mL 腹透液以及靜脈血，離心后置于-80 ℃冰箱保存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的方法，按照試劑盒（R&D 公司，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)檢測(cè)透出液和外周血IL?36α、IL?36β、IL?36γ、IL?6 的濃度，而細(xì)胞因子呈現(xiàn)率（appearance rate，AR）=腹透液細(xì)胞因子濃度（ng/mL）×透出液量（mL）/留腹時(shí)間（min）。PET評(píng)估腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并收集24 h尿液和腹透液評(píng)估腹透充分性、尿素清除指數(shù)（Kt/V）。

1.2.2 PET試驗(yàn)

晨起后引出留置腹腔過(guò)夜的腹膜透析液（20 min以上），隨后在10 min 內(nèi)以200 mL/min 的速度灌入2.5%葡萄糖腹透液2 L（百特，鈣濃度：1.25 mmol/L），每灌入400 mL變更體位，使腹透液充分混合，完畢后計(jì)時(shí)，使液體停留于腹腔4 h，后利用20 min排空腹腔內(nèi)透析液，計(jì)量，并分別取0、2、4 h 的腹透液標(biāo)本10 min，并取灌入腹透液2 h的外周血標(biāo)本，在全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（BECKMANC?OULTER DxC800）上檢測(cè)肌酐及葡萄糖濃度，并采用美國(guó)密蘇里大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的校正因子（0.000 531 415）校正肌酐。患者依據(jù)PET 結(jié)果進(jìn)行分組，高轉(zhuǎn)運(yùn)組（D/P Cr=0.82～1.03，H組），高平均轉(zhuǎn)運(yùn)組（D/P Cr=0.65～0.81，HA組），低平均轉(zhuǎn)運(yùn)組（D/P Cr=0.50～0.64，LA 組），低轉(zhuǎn)運(yùn)組（D/P Cr=0.34～0.49，L組）。由于高轉(zhuǎn)運(yùn)組和低轉(zhuǎn)運(yùn)組病例較少，本研究將上述患者分為H/HA和L/LA組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Kolmogorov?Smirnov 檢驗(yàn)法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量的描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），不符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量的描述采用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］，分類(lèi)變量的描述采用百分比。正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，采用SNK 法或Kruskall?Wallis 法進(jìn)行兩兩比較。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)，分類(lèi)變量的組間比較使用χ2檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。應(yīng)用多因素Logistic 回歸分析影響腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性（D/P Cr）或CAPD 患者不良事件的預(yù)測(cè)因素，且各個(gè)協(xié)變量之間經(jīng)方差膨脹因子（vari?ance inflation factor，VIF）檢測(cè)，無(wú)明顯共線(xiàn)性。通過(guò)受試者工作特征曲線(xiàn)（receiver operating characteris?tic curve，ROC）及曲線(xiàn)下面積（area under curve，AUC）評(píng)價(jià)腹透液IL?36家族對(duì)于腹透溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性和不良事件的預(yù)測(cè)價(jià)值。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

111 例CAPD 患者中，男65 例，女46 例；70 例屬于H/HA 組，41 例屬于L/LA 組。L/LA 組血清白蛋白、血紅蛋白、D/D0、血磷、4 h超濾量明顯低于H/HA組；D/P Cr、腹透液IL?6 AR 明顯高于H/HA 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而兩組在性別、年齡、腹透時(shí)間、高血壓患病率、糖尿病患病率、心血管疾病患病率、血鈣、甘油三酯、膽固醇、尿酸、肌酐、eGFR、甲狀旁腺素上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 H/HA組和L/LA組臨床特征及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果Table 1 Clinical and laboratory parameters in H/HA group and L/LA group

2.2 腹透流出液及血清中IL?36水平與PET試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性分析

ELISA結(jié)果顯示，腹透液中IL?36α AR為（7.66±4.48）ng/min，IL?36β AR 為（40.24±5.23）ng/min，IL?36γ AR 為（37.41±15.72）ng/min；血清中IL?36α為（2.31±0.92）ng/mL，IL?36β 為（15.32±3.11）ng/mL，IL?36γ為（18.22±3.35）ng/mL。Pearson相關(guān)分析的結(jié)果顯示，CAPD 患者中腹透液IL?36αAR、IL?36γAR 和PET 試驗(yàn)中D/P Cr 呈正相關(guān)（分別為r=0.51，P＜0.001；r=0.55，P＜0.001），與D/D0 呈負(fù)相關(guān)（分別為r=-0.40，P＜0.001；r=-0.44，P＜0.001），與4 h 超濾量無(wú)明顯相關(guān)性。而血清中IL?36 和PET 結(jié)果無(wú)明顯相關(guān)性（表2，圖1）。

表2 PET試驗(yàn)結(jié)果和腹透流出液或血清中IL?36的相關(guān)性分析Table 2 Correlation of the PET results and IL?36 in se?rum or peritoneal dialysis effluent

圖1 D/P Cr與腹透流出液IL?36α AR（A）及IL?36γ AR（B）的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation of D/P Cr and effluent IL?36α AR（A）or IL?36γ AR（B）

2.3 腹透流出液中IL?36對(duì)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

以腹膜透析溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性為因變量（H/HA 和L/LA），建立未校正前，以及經(jīng)H/HA 和L/LA 組間具有顯著差異的IL?6 AR、血清白蛋白、超濾量、血磷以及性別、年齡校正后的模型進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示IL?36α AR 及IL?36γ AR 是預(yù)測(cè)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的預(yù)測(cè)因素（分別是OR=1.35，P＜0.001；OR=1.07，P＜0.001）；而校正后，IL?36α AR及IL?36γ AR仍然是預(yù)測(cè)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（分別是OR=1.40，P=0.001；OR=1.08，P=0.016）。AUC 結(jié)果顯示，IL?36α AR 為0.75（95%CI：0.66～0.84）；IL?36γ AR為0.79（95%CI 0.70～0.88，圖2）。

圖2 腹透流出液IL?36α AR以及IL?36γ AR預(yù)測(cè)腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性的ROC曲線(xiàn)Figure 2 ROC curve with effluent IL?36α AR or IL?36γ AR for prediction of peritoneal solute transport rate

2.4 IL?36對(duì)CAPD患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

隨訪(fǎng)17 個(gè)月，將因超濾衰竭轉(zhuǎn)為血液透析、出現(xiàn)新發(fā)心血管疾病、死亡定義為不良事件。111 例患者中，3例死亡（H/HA組2例，L/LA組1例），7例因超濾衰竭轉(zhuǎn)為血液透析（H/HA組6例，L/LA組1例），12例出現(xiàn)新發(fā)心血管疾病（包括心力衰竭、急性心肌梗死、心律失常、心搏驟停、腦血管意外，其中H/HA組9例，L/LA 組3例），利用Logistic 回歸模型分析建立未校正前，以及將性別、年齡、超濾量、透析時(shí)間、血白蛋白、血鈣、血磷、Kt/V、是否患有高血壓、是否患有糖尿病、是否患有心血管疾病、肌酐、甲狀旁腺激素作為校正因素的模型，結(jié)果提示腹透流出液IL?36α AR 是CAPD 患者不良事件發(fā)生的預(yù)測(cè)因素（OR=1.28，95%CI：1.12～1.46，P=0.001），而經(jīng)校正后，腹透流出液IL?36α AR仍然是CAPD患者不良事件發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（OR=1.21，95%CI：1.06～1.39，P=0.006），AUC為0.76（95%CI：0.64～0.89，圖3）。

圖3 腹透流出液IL?36 AR 預(yù)測(cè)腹膜透析患者不良事件的ROC曲線(xiàn)Figure 3 ROC curve with effluent IL?36 AR for predic?tion of adverse outcomes in peritoneal dialysis patients

3 討論

目前我國(guó)有超過(guò)7 萬(wàn)例ESRD 患者接受腹膜透析為腎臟替代治療方式，腹膜透析可以較大程度減輕對(duì)生活和工作的影響。但隨著腹透時(shí)間的延長(zhǎng)，腹膜出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常（表現(xiàn)為腹膜纖維化、新生血管形成以及血管透明樣變性），并出現(xiàn)腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率增高以及超濾衰竭［1，11-12］。一般認(rèn)為因腹膜長(zhǎng)期暴露于生物不相容的透析溶液、尿毒癥毒素、高糖環(huán)境等因素下，腹腔中巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞激活，分泌炎癥因子，導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞分泌促纖維化因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，導(dǎo)致大量伴有α平滑肌肌動(dòng)蛋白、膠原形成的肌成纖維細(xì)胞在腹膜聚集，最終引起腹膜纖維化以及腹膜功能的喪失［13-16］。因此，慢性炎癥狀態(tài)可能是腹膜功能損傷的起始因素，多項(xiàng)研究已經(jīng)表明腹膜間皮細(xì)胞分泌IL?6、基質(zhì)金屬蛋白酶等，表達(dá)水平隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，并且與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率以及腹透的臨床不良事件相關(guān)，提示相關(guān)炎癥因子可能是反映腹腔慢性炎癥狀態(tài)及腹膜功能的良好指標(biāo)［6，17］。而目前臨床中普遍應(yīng)用PET 試驗(yàn)作為評(píng)估腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型的方式，但是該檢測(cè)需要住院、過(guò)程相對(duì)繁瑣，并耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，因此尋求腹透液中可能的炎癥因子作為生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)腹膜功能，易于標(biāo)本收集及檢測(cè)，具有重要意義。

本研究報(bào)道了在腹膜透析流出液中可以檢測(cè)出IL?36，分析CAPD 患者PET 試驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)IL?36α、IL3?6γ與PET 試驗(yàn)中D/P Cr 呈正相關(guān)，與D/D0呈負(fù)相關(guān)，提示腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率增高的患者IL?36α、IL?36γ升高；Logistic 回歸分析結(jié)果提示IL?36α、IL?36γ是腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特性的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素；另外每例患者隨訪(fǎng)17個(gè)月，由于心血管事件往往與腹膜功能下降后液體負(fù)荷過(guò)重相關(guān)，并且是腹透患者死亡的主要原因［4，11］，因此本研究將因超濾衰竭轉(zhuǎn)為血液透析、新發(fā)心血管事件（心力衰竭、急性心肌梗死、心律失常、心搏驟停、腦血管意外）、死亡定義為不良事件，發(fā)生率為16.20%（H/HA 組為24.29%，L/LA組為12.20%，χ2=2.34，P=0.15），Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)校正混雜因素后，IL?36α仍然是CAPD患者發(fā)生不良事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。既往一項(xiàng)針對(duì)超過(guò)1 萬(wàn)例CAPD 患者PET 試驗(yàn)的結(jié)果表明，D/P Cr 與D/D0 高度相關(guān)，并且是住院率及全因死亡率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，而4 h超濾量與D/P Cr僅僅是弱相關(guān)，并且與住院率及全因死亡率無(wú)明顯相關(guān)性，因此本研究與該研究結(jié)果一致，腹透液IL?36濃度和PET試驗(yàn)中4 h超濾量無(wú)明顯相關(guān)性，但I(xiàn)L?36α仍然是CAPD患者發(fā)生不良事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

在隨訪(fǎng)的111 例CAPD 患者中，63%屬于H/HA組，比例與其他多中心的研究結(jié)果一致（47.4%～83.0%）［7，18］；在臨床指標(biāo)中，我們發(fā)現(xiàn)相較于L/LA組，H/HA組伴有更低的白蛋白和血紅蛋白水平，其可能原因是：①隨著腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率增高，往往伴隨著更高的白蛋白以及鐵蛋白清除率；②葡萄糖快速以及大量入血后降低患者食欲，減少蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入；③H/HA組微炎癥狀態(tài)較重，而炎癥因子會(huì)抑制促紅細(xì)胞生成素活性，加重腎性貧血［19-21］。另外本研究數(shù)據(jù)表明H/HA組患者血磷水平較L/LA組明顯降低，Bernardo 等［22］報(bào)道血磷的腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率與D/P Cr有明顯相關(guān)性，與本研究的結(jié)果相一致。

IL?36基因位于人類(lèi)2號(hào)染色體上，研究表明IL?36是IL?1家族中重要的促炎因子，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)并成為自身免疫性疾病的治療靶點(diǎn)。IL?36α、IL?36β、IL?36γ信號(hào)通過(guò)結(jié)合其受體IL?36R，招募IL?1受體輔助蛋白（IL?1RAcP）激活下游NF?κB 以及MAPK 炎癥信號(hào)通路，此外IL?36 還可以通過(guò)M2 型巨噬細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，增強(qiáng)Th1和Th17的反應(yīng)，同時(shí)在對(duì)固有免疫反應(yīng)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［8，23］。本研究發(fā)現(xiàn)H/HA組較L/LA組，腹透流出液中IL?36α、IL?36γ以及IL?6水平均顯著升高，因此IL?36α及IL?36γ在腹透液中表達(dá)水平增高能夠提示腹腔微炎癥狀態(tài)加重；另外隨著IL?36α、IL?36γ水平的增高，其可進(jìn)一步通過(guò)活化炎癥反應(yīng)加重腹膜損傷。目前大量研究表明IL?36在不同類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)和分泌，如T淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等［9，23］，而本研究發(fā)現(xiàn)血清中IL?36的水平在H/HA組與L/LA組中無(wú)明顯變化，提示腹腔中表達(dá)增多的IL?36主要來(lái)源于腹膜固有細(xì)胞。針對(duì)IL?36的不同亞型，本研究發(fā)現(xiàn)腹透流出液中IL?36α與IL?36γ的表達(dá)與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率相關(guān)，而IL?36β水平在H/HA 組與L/LA 組中無(wú)明顯變化。既往研究表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者以及炎癥性腸病患者中血清IL?36α與IL?36γ較健康組顯著升高，且與疾病進(jìn)展相關(guān)；而視神經(jīng)脊髓炎患者血清IL?36β與IL?36γ表達(dá)水平較健康人群高［9-10］，但I(xiàn)L?36α水平與健康人群無(wú)明顯差異。因此IL?36α、IL?36β、IL?36γ在不同疾病以及組織中的表達(dá)和作用不盡相同，有待進(jìn)一步研究。

本研究存在著一些局限性，首先這是一項(xiàng)單中心研究，樣本量較少，仍需在多中心、大樣本的人群中驗(yàn)證；本研究隨訪(fǎng)時(shí)間相對(duì)較短，對(duì)于腎臟不良事件的觀察具有局限性，未能動(dòng)態(tài)檢測(cè)患者腹透流出液中IL?36的變化；針對(duì)IL?36來(lái)源于腹膜中的具體細(xì)胞類(lèi)型，以及IL?36 對(duì)腹膜纖維化的影響需要?jiǎng)游锛凹?xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腹透流出液中IL?36α與IL?36γ可能是由腹膜固有細(xì)胞直接產(chǎn)生和分泌，其表達(dá)水平和腹膜損傷程度密切相關(guān)，能夠用于監(jiān)測(cè)和判斷腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型，并具有較高的靈敏度和特異床；腹透流出液中IL?36α是CAPD 患者出現(xiàn)不良事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。因此，檢測(cè)CAPD 患者腹透流出液中IL?36 水平，對(duì)于臨床上判斷腹膜透析轉(zhuǎn)運(yùn)類(lèi)型、早期調(diào)整腹透方案、判斷腹透患者預(yù)后等可能具有重要參考價(jià)值。