劉昊，韓昌勝，遲顯蘇，楊振霄，王祥宇，王新，馬柯

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

1.1.2 實驗藥物

地西泮、PCPA、吐溫80、生理鹽水(山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗室)，酸棗仁湯(山東中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂醫(yī)院)。

1.1.3 實驗儀器

BAS224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，5 mL、10 mL注射器(江西洪達醫(yī)療器械集團有限公司)，灌胃針頭(北京創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司)，曠場實驗系統(tǒng)(上海欣軟XR-XZ301)，高架十字迷宮系統(tǒng)(上海欣軟XR-XG201)，SMART 3.0動物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)、SuperMaze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)、大鼠雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海宸功生物公司)，離心機(力辰科技 LC-LX-HL210D)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備

酸棗仁湯根據(jù)仲景原方換算，為計算方便，按照古代的1兩相當于16 g來換算 ，酸棗仁湯配方劑量為：酸棗仁110 g[10]、茯苓32 g、川芎32 g、知母32 g和甘草16 g，煎取600 mL，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

因PCPA較難溶于水，故先用吐溫80助溶，再加入生理鹽水配制成溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。地西泮粉末經(jīng)生理鹽水溶解后配置成溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 動物分組

實驗動物按照隨機數(shù)字法分為4組，分別為酸棗仁湯組、地西泮組、模型組和空白組。每 10 只大鼠(雌雄各半)為一組，雌雄兩性分別置于兩個 RVC 籠子內(nèi)，大鼠的飼料和飲水采用任食任飲方式。

1.2.3 造模方法

實驗采用腹腔注射PCPA的方法構(gòu)建大鼠失眠模型，將需要配制使用的PCPA混合搖勻，模型組、地西泮組、酸棗仁湯組于每日7：30—8：30按 350 mg /kg以 10 mL /kg 腹腔注射給藥，1次/d，持續(xù)3 d。對照組在相同時間腹腔注射等量生理鹽水。

注射完成后，大鼠造模成功的標志為其出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白晝不停活動，出現(xiàn)不安、躁動等表現(xiàn)[11]。

1.2.4 治療給藥

造模成功后，于造模結(jié)束后第2 d開始每日8:00給藥，連續(xù)給藥14 d，給藥的濃度、劑量根據(jù)人與大鼠體表面積換算公式計算。酸棗仁湯組按體表面積法換算成大鼠的等效劑量50 g/kg，按照每只大鼠10 mL/kg每日行灌胃給藥；地西泮組按體表面積法換算為1 mg/kg，按照每只大鼠10 mL/kg每日例行灌胃;模型組和空白組根據(jù)換算方法給予等體積生理鹽水每日例行灌胃。

1.3 大鼠行為、情緒評價

1.3.1 曠場實驗

所有大鼠于造模結(jié)束后一天, 先讓其適應(yīng)實驗室內(nèi)安靜照明環(huán)境1 h后，將其放置于曠場實驗箱正中央, 實驗箱正上方攝像頭及相關(guān)視頻跟蹤系統(tǒng)會記錄大鼠5 min內(nèi)的運動總距離、中心區(qū)停留時間以及進入次數(shù)[12]，追蹤系統(tǒng)與電腦相連，有相關(guān)數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)。每只大鼠于實驗結(jié)束后取出，并清理實驗箱一次, 用75%的酒精擦拭實驗箱防止氣味等因素干擾。

1.3.2 高架十字迷宮實驗

1.4 檢測指標

1.4.1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定

腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-HT及其代謝產(chǎn)物。首先按照1. 0 mL/kg體質(zhì)量注射劑量給各組大鼠腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為3%的戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，麻醉成功的指標為注射后仰臥位翻正反射且無疼痛反應(yīng)。麻醉成功后用提前經(jīng)過消毒處理的手術(shù)器械剖開大鼠腹腔，分離前面的臟器及脂肪，找到腹主動脈，用一次性真空采血管取動脈血。取血后室溫靜置1 h，然后用離心機3000 r/min離心10 min，離心完成后分離上層純凈透明的血清[14]，制成樣本液。用大鼠雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒依次經(jīng)過標準品的稀釋、溫育、配液、洗滌、溫育、洗滌、顯色、終止、測定等步驟測出各孔的吸光度，再根據(jù)試劑盒中的說明書計算出NE、DA、5-HT的含量。

1.4.2 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)檢測

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)包括Glu、GABA等。最后一次給藥處理后30 min內(nèi)處死并參照1.4.1節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測中腹主動脈取血、離心的步驟用ELISA法測定吸光度，根據(jù)試劑盒使用說明計算出Glu、GABA的含量。

1.4.3 血清中炎癥相關(guān)因子TNF-a、 IL-1β、 IL-10含量檢測

最后一次給藥處理后30 min抽取大鼠腹主動脈的血液，靜置，離心機3000 r /min 離心 10 min，分離出上層純凈的血清，制成樣本液，采用ELISA法吸附測定檢測血清中炎癥相關(guān)因子TNF-α、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為、情緒評價結(jié)果

2.1.1 曠場實驗結(jié)果

與空白組相比，PCPA誘導(dǎo)的失眠大鼠在曠場實驗中總距離顯著降低(P<0.05)，中央?yún)^(qū)域的進入次數(shù)與持續(xù)時間降低不明顯(P>0.05)，見表1。各組的曠場實驗軌跡圖對比見圖1，圖中結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠在曠場實驗中的總距離明顯減少，酸棗仁湯治療后大鼠在曠場實驗的總距離和中央?yún)^(qū)域進入次數(shù)較模型組增加。

表1 空白組與模型組大鼠的曠場實驗結(jié)果Table 1 Results of open-field experiment in model or control group

注：為方便計算大鼠進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)和停留時間，將曠場平均劃分為九個區(qū)，其中最中間的區(qū)域為中央?yún)^(qū)域。圖1 各組大鼠的曠場實驗活動軌跡圖Fig.1 Activity-tracking graph of open field experiment in each group

2.1.2 高架十字迷宮實驗結(jié)果

與空白組相比，PCPA誘導(dǎo)的失眠大鼠在高架十字迷宮實驗中其開臂停留時間百分比toc和進入開臂次數(shù)百分比Noc均有所降低，其中toc降低比較顯著(P<0.05)，而Noc降低不明顯(P>0.05)，見表2。各組的高架十字迷宮活動軌跡圖對比見圖2。圖中結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠進入開臂的次數(shù)明顯減少，酸棗仁湯治療后大鼠進入高架十字迷宮開臂的次數(shù)較模型組增加。

表2 空白組與模型組大鼠的高架十字迷宮實驗結(jié)果

注：在上述高架十字迷宮圖中，a、c兩臂(橫臂)為封閉臂，b、d兩臂(縱臂)為開放臂。圖2 各組大鼠的高架十字迷宮實驗活動軌跡圖Fig.2 Activity-tracking graph of elevated plus-maze experiment in each group

2.2 檢測指標結(jié)果

2.2.1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測定結(jié)果

與空白組相比，模型組5-HT含量顯著降低(P<0.05)，DA含量顯著升高(P<0.05)，NE含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，酸棗仁湯組5-HT含量顯著升高(P<0.05)，DA含量顯著降低(P<0.01)；而NE含量升高不明顯(P>0.05)，見表3。

表3 各組單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量Table 3 Monoamine neurotransmitter levels in each group

2.2.2 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)檢測結(jié)果

與空白組相比，模型組Glu含量顯著升高(P<0.05)，GABA含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，地西泮組和酸棗仁湯組Glu含量顯著降低(P<0.01)，GABA含量均顯著升高(P<0.01)，見表4。

表4 各組Glu、GABA含量

2.2.3 血清中炎癥相關(guān)因子TNF-a、 IL-1β、 IL-10含量檢測結(jié)果

與空白組相比，模型組TNF-α、IL-1β含量顯著升高(P<0.01)，IL-10含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，地西泮組TNF-α顯著降低(P<0.01)，酸棗仁湯組升高不明顯；地西泮組、酸棗仁湯組IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，IL-10含量顯著升高(P<0.01)，見表5。

表5 各組血清中炎癥相關(guān)因子含量

3 討論

本實驗采用了國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者比較認同的PCPA失眠模型[15]，并采用了曠場實驗、高架十字迷宮實驗進行模型的行為學(xué)評估。歐陽俊彥等[16]根據(jù)曠場實驗結(jié)果認為，焦慮大鼠中央?yún)^(qū)域停留時間明顯減少，而且其總的運動距離無顯著性；張鵬橫等[17]則認為焦慮水平高的動物會更傾向于停留在四周的區(qū)域，而焦慮水平低的大鼠對中央?yún)^(qū)域的探究次數(shù)和時間會比較多。高架十字迷宮實驗是用來考察大鼠焦慮狀態(tài)的常用考量工具，主要是利用了大鼠對新鮮環(huán)境的好奇、探究的天性和對高懸的開放臂的恐懼心理形成的矛盾沖突。李寧等[18]指出在該項目中,對于有焦慮的動物來說，其Noc和toc會明顯降低,而經(jīng)典抗焦慮藥物則使兩者升高。失眠大鼠在失眠的同時通常會伴有焦慮等癥狀，后期隨著失眠程度加重可能會出現(xiàn)抑郁等其他癥狀。實驗結(jié)果顯示，造模后的大鼠相比于空白組，其曠場實驗運動總距離明顯降低，中央?yún)^(qū)域的進入次數(shù)與持續(xù)時間降低，但是降低不明顯；而高架十字迷宮的結(jié)果則顯示其toc和Noc均下降，其中toc下降比較顯著。曠場實驗中大鼠對中央?yún)^(qū)域的探索情況一定程度上表現(xiàn)了大鼠的焦慮水平，高架十字迷宮中大鼠對開臂的探索在一定程度上表現(xiàn)了大鼠好奇度及對未知外界環(huán)境的興趣，本實驗得出的結(jié)果說明造模后的大鼠相比于空白組的大鼠來說，其對中央?yún)^(qū)域的探索度降低，在曠場中運動度明顯減少，有一定的焦慮癥狀出現(xiàn)，導(dǎo)致其對環(huán)境的興趣和探索降低，這與臨床中多數(shù)失眠患者出現(xiàn)焦慮，對事物好奇心、探索度降低有相似之處。

黎發(fā)根等[19]認為中藥治療失眠的作用機制可能有以下幾種:一是中藥中蘊含的某些有效成分通過調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(5-HT、GABA)等及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(如Glu、NE、DA等)的含量來治療失眠;二是通過影響某些炎性細胞因子如IL-1、TNF-α等和某些睡眠相關(guān)因子來影響失眠;三是通過改善大腦皮層或者中腦中縫背核中的某些中樞神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)來改善失眠。林臘梅[20]根據(jù)實驗結(jié)果得出酸棗仁湯治療失眠可能是通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與Glu神經(jīng)遞質(zhì)的含量來實現(xiàn)的。 王慧等[11]在實驗探究PCPA 失眠模型作用機制中5-HT 與Glu遞質(zhì)系統(tǒng)的關(guān)系時，認為酸棗仁湯可能是通過干預(yù)腦內(nèi)代謝型Glu受體的mRNA及其受體后信號分子cAMP和PKA mRNA的表達來改善5-HT合成障礙，進而干預(yù)改善失眠。李家豪等[21]經(jīng)過實驗認為酸棗仁湯能夠有效調(diào)節(jié)老年睡眠剝奪大鼠的晝夜節(jié)律，并提出酸棗仁湯改善睡眠的作用機制可能與其能調(diào)節(jié)大鼠5-HT及其受體的表達有關(guān)。現(xiàn)代研究已經(jīng)證明某些細胞因子與調(diào)控睡眠的覺醒周期有關(guān)，如助眠因子白介素1(IL-1)、TNF-α、IL-6；而另一些炎性因子可能會通過影響慢波睡眠進而導(dǎo)致失眠，如IL-1β、白介素4(IL-4)、IL-10；石皓月等[22]在分析整理中藥對PCPA失眠模型的作用時、提出由中藥調(diào)節(jié)的睡眠作用機制可能與機體內(nèi)炎性因子濃度改變或者炎癥相關(guān)。

本實驗研究了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)、炎性相關(guān)因子與失眠治療的關(guān)系，以此來推測酸棗仁湯治療失眠可能存在的機制。所研究的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括NE、DA、5-HT，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括Glu、GABA。實驗結(jié)果表明，與模型組相比，酸棗仁湯組5-HT、GABA含量顯著升高，而NE含量升高但不明顯； DA、Glu含量顯著降低。說明酸棗仁湯可能是通過增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(如5-HT、GABA)，減小興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(如DA、Glu)的含量來治療失眠的，本實驗中NE含量升高，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義，可能受多種因素影響，后期有待于進一步研究。通過分析炎性細胞因子含量的變化，酸棗仁湯組對比模型組促炎性細胞因子IL-1β含量顯著降低，抗炎性細胞因子IL-10含量顯著升高，說明酸棗仁湯可能通過調(diào)節(jié)促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的水平來進一步緩解失眠。與地西泮組相比，DA和TNF-α有差異，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中酸棗仁湯組DA含量降低更加顯著，地西泮組TNF-α顯著降低；而5-HT、GABA、NE、Glu、IL-1β、IL-10含量變化趨勢相同，且無顯著差異。說明酸棗仁湯與地西泮治療失眠的作用機制可能存在相似性，均可以通過調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的含量、調(diào)節(jié)炎性細胞因子的含量來治療失眠。而西藥地西泮的主要作用機制可能是通過影響參與Glu轉(zhuǎn)化為GABA的主要代謝酶GAD的表達來促進GABA與GABA-α受體的結(jié)合，從而產(chǎn)生抑制效應(yīng)，進而起到鎮(zhèn)靜催眠的作用[23]。本實驗結(jié)果則表明了酸棗仁湯組與地西泮組對某些指標的含量的改變略有不同，說明其作用機制可能也存在差異。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過腹腔注射PCPA造模成功的失眠大鼠在造模后一定程度上出現(xiàn)焦慮現(xiàn)象，這與臨床上某些失眠人群出現(xiàn)焦躁不安的現(xiàn)象比較相似。酸棗仁湯在治療失眠方面的作用機制可能與其能增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的含量、調(diào)節(jié)炎性細胞因子的水平有關(guān)，酸棗仁湯與地西泮的作用有一定的相似之處。本實驗著重研究了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)、炎性相關(guān)因子與失眠治療的關(guān)系，實驗結(jié)果表明酸棗仁湯可以通過增加5-HT、GABA，減小DA、Glu含量，調(diào)節(jié)炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-10來治療失眠。