秦文英陳麗華高方方

(河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科,河南 洛陽 471002)

骨肉瘤是常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤,好發(fā)于兒童和青少年,易引起嚴(yán)重并發(fā)癥,導(dǎo)致殘疾,嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。骨肉瘤發(fā)病率較高,僅次于腦腫瘤和淋巴瘤,具有惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點,其復(fù)發(fā)或發(fā)生轉(zhuǎn)移會影響預(yù)后,降低患者5年生存率[2-3]。目前,甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑等常用臨床化療藥物在骨肉瘤化療中出現(xiàn)的耐藥性及毒副作用逐漸成為制約其發(fā)展的主要問題,而靶向治療等治療骨肉瘤的新方法尚處于起步階段,其有效性及安全性還需大量臨床資料證實[4]。因此,尋找一種安全、有效的藥物來延緩骨肉瘤進展具有重要價值。普魯卡因是一種脂溶性局部麻醉藥物,已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉中,近年研究發(fā)現(xiàn),普魯卡因在腫瘤治療領(lǐng)域也有一定作用,目前在肺癌、肝癌、胃癌等癌癥中已有初步研究[5]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶/黏著斑激酶(extracellular signal regulated kinase/mitogen activated protein kinase/focal adhesion kinase,ERK/MAPK/FAK)通路與多種癌細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)[6-8]。本研究通過研究普魯卡因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖、遷移及侵襲行為的影響,并探討可能存在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2(貨號:QY-x646)購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

普魯卡因、蛋白提取試劑盒(貨號:IP0390-1、BC3640)購自Solarbio;Y15(貨號:T7119)購自美國TargetMol;DMEM培養(yǎng)基(貨號:KL-P0032)購自德國sigma;CCK-8(貨號:CK-04)購自日本同仁;AnnexinV-FITC/PI試劑盒(貨號:S0185)購于哈爾濱新?；驒z測有限公司;Matrigel基質(zhì)膠(貨號:356234)購自美國BD;結(jié)晶紫染液、BCA蛋白測定試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號:E607309-0100、C503021-0500、D601039-0050)購自生工生物工程有限公司;p-ERK抗體、ERK抗體、p-p38 MAPK抗體、p38 MAPK抗體、p-FAK抗體、FAK抗體、GAPDH抗體(貨 號:ab223500、ab17942、ab4822、ab31828、ab4792、ab40794、ab181602)購自英國abcam;羊抗兔IgG二抗(貨號:0295 G-HRP)購自美國santa;MIR-262-PC培養(yǎng)箱購于日本松下;MODEL550酶標(biāo)儀及ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad;BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀購于美國BD;CX31顯微鏡購自日本Olympus。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)內(nèi)培養(yǎng),融合75%后,消化、傳代培養(yǎng)。

取處于對數(shù)生長期的Saos-2細(xì)胞,每毫升接種1×105個于96孔培養(yǎng)板,每孔加100 μL,分為對照組、普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組,對照組為不含藥物的完全培養(yǎng)液,普魯卡因組加終濃度為2 μmol/L的普魯卡因,Y15組加入終濃度為10 μmol/L的Y15,普魯卡因+Y15組加入終濃度為2 μmol/L的普魯卡因及終濃度為10 μmol/L的Y15[9]。

1.3.2 CCK-8法檢測各組Saos-2細(xì)胞增殖情況

將Saos-2細(xì)胞按照1.3.1分組處理后分別培養(yǎng)24、48和72 h,加CCK-8,培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀(450 nm)檢測吸光度(OD)值。藥物處理組按下列公式計算細(xì)胞存活率(%)=OD藥物處理組/OD對照組×100%

1.3.3 流式細(xì)胞儀測定各組Saos-2細(xì)胞凋亡情況

Saos-2細(xì)胞按照1.3.1分組處理,培養(yǎng)48 h,細(xì)胞收集、消化、洗滌,使用結(jié)合緩沖液調(diào)整為每毫升1×106個的細(xì)胞懸液,按照相應(yīng)試劑盒說明書步驟,依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL,黑暗處孵育1 h,流式細(xì)胞儀測定Saos-2細(xì)胞的凋亡率。

1.3.4 Transwell法檢測各組Saos-2細(xì)胞遷移情況

用無血清培養(yǎng)液將1.3.1中各組Saos-2細(xì)胞稀釋為每毫升2.0×105個細(xì)胞的懸液,向Transwell小室上室加200 μL,下室加10%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h,擦去未穿膜細(xì)胞,用4%多聚甲醛10 min,PBS洗滌,0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min,PBS洗滌。倒置在200倍鏡的顯微鏡下,隨機選取6個視野,觀察并拍照,統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù),計算平均值。

1.3.5 Transwell法檢測各組Saos-2細(xì)胞侵襲情況

用無血清培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠,向Transwell小室上室中加50 μL,37℃過夜凝固,后續(xù)操作按照1.3.4中細(xì)胞遷移情況檢測步驟進行操作,隨機選6個視野,統(tǒng)計侵襲細(xì)胞數(shù),計算其平均值。

1.3.6 蛋白印跡(Western blot)法檢測各組Saos-2細(xì)胞中ERK/MAPK/FAK通路相關(guān)蛋白表達情況

將Saos-2細(xì)胞按照1.3.1分組處理,培養(yǎng)48 h,細(xì)胞收集、提取總蛋白、定量。電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PDVF膜,含5%脫脂奶粉的TBST進行封閉1,分別加入p-ERK抗體(1∶500)、ERK抗體(1∶500)、p-p38 MAPK抗體(1∶500)、p38 MAPK抗體(1∶500)、p-FAK抗體(1∶500)、FAK抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶500),4℃過夜,洗滌,加羊抗兔IgG二抗(1∶5000),常溫孵育1 h,發(fā)光法顯色后拍攝圖像,分析條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較進行單因素方差分析,兩兩比較進行SNKq檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Saos-2細(xì)胞增殖情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞存活率均顯著降低(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞存活率均顯著降低(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞存活率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組Saos-2細(xì)胞存活率比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of Saos-2 cell survival rates in each group

表1 各組Saos-2細(xì)胞存活率比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of Saos-2 cell survival rates in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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2.2 各組Saos-2細(xì)胞凋亡情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組Saos-2細(xì)胞凋亡情況Figure 1 Apoptosis of Saos-2 cell in each group

表2 各組Saos-2細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of Saos-2 cell apoptosis rates in each group

表2 各組Saos-2細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of Saos-2 cell apoptosis rates in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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2.3 各組Saos-2細(xì)胞遷移情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2、表3。

表3 各組Saos-2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of Saos-2 cell migration numbers in each group

表3 各組Saos-2細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of Saos-2 cell migration numbers in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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圖2 各組Saos-2細(xì)胞遷移情況Figure 2 Migration of Saos-2 cell in each group

2.4 各組Saos-2細(xì)胞侵襲情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3、表4。

表4 各組Saos-2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較(xˉ±s,n=6)Table 4 Comparison of Saos-2 cell invasion numbers in each group

圖3 各組Saos-2細(xì)胞侵襲情況Figure 3 Invasion of Saos-2 cell in each group

2.5 各組Saos-2細(xì)胞中ERK/MAPK/FAK通路相關(guān)蛋白表達情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì) 胞 中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05);與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細(xì)胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖4、表5。

表5 各組Saos-2細(xì)胞中ERK/MAPK/FAK通路相關(guān)蛋白表達情況比較(±s,n=6)Table 5 Comparison of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

表5 各組Saos-2細(xì)胞中ERK/MAPK/FAK通路相關(guān)蛋白表達情況比較(±s,n=6)Table 5 Comparison of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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圖4 Western blot檢測各組Saos-2細(xì)胞中ERK/MAPK/FAK通路相關(guān)蛋白表達情況Figure 4 Western blot analysis of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

3 討論

骨肉瘤起源于骨間葉細(xì)胞,是常見的原發(fā)性惡性腫瘤,含有大量未成熟的骨或骨樣組織,惡性程度高且易發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。目前通常采用手術(shù)切除轉(zhuǎn)移灶、放化療及分子靶向療法等對骨肉瘤進行治療,都具有一定治療效果。然而,這些治療手段仍存在一定缺陷,例如,手術(shù)療法容易產(chǎn)生較大創(chuàng)傷,放化療法的敏感性相對不高,且化療具有明顯的不良反應(yīng),明顯降低了患者的生存質(zhì)量,而分子靶向療法的治療費用相對較昂貴,易對患者造成巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[11-13]。臨床研究表明,骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率是骨肉瘤治療的主要問題[14-15]。因此,探索能夠干預(yù)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的新治療手段迫在眉睫,一些高效、安全、便宜的可能用于骨肉瘤治療的藥物逐漸引起了人們的關(guān)注。

普魯卡因是一種局部麻醉藥物,在臨床麻醉中,具有麻醉效果好、藥物毒性低等優(yōu)點。近年研究發(fā)現(xiàn),普魯卡因可以對腫瘤細(xì)胞進行DNA去甲基化,可以增加幾種常用抗癌藥物的抗腫瘤活性,對放射治療具有增敏作用[5]。然而,普魯卡因在骨肉瘤中的研究尚不完善。Ying等[16]研究發(fā)現(xiàn),普魯卡因能夠通過上調(diào)microRNA-133b表達抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移,并促進細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,普魯卡因組Saos-2細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組均顯著降低,細(xì)胞凋亡率較對照組均顯著升高,表明普魯卡因?qū)aos-2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲均具有明顯的抑制作用。

ERK/MAPK/FAK通路是腫瘤發(fā)生遷移、侵襲的常見信號通路,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,其中ERK、p38 MAPK、FAK是這一通路的重要成員,激活后可產(chǎn)生、分泌多種細(xì)胞因子,通過抑制腫瘤抑制因子活化,在腫瘤形成的任何時期均可發(fā)揮促進惡性腫瘤細(xì)胞存活及轉(zhuǎn)移的作用[9]。蘇小桃等[17]研究表明,二甲雙胍可抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的遷移和侵襲能力,可能是通過下調(diào)埃茲蛋白和MAPK/Erk信號通路而實現(xiàn)。曹飛等[18]研究表明,賴氨酸羥化酶2促進骨肉瘤遷移和侵襲的機制可能與激活FAK/JAK2-STAT3信號通路有關(guān)。Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn),FAK可能通過促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。既往研究發(fā)現(xiàn),化療的輔助藥物普魯卡因,對脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲具有抑制作用[20]。本研究結(jié)果顯示,普魯卡因組Saos-2細(xì)胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK

蛋白表達水平較對照組均顯著降低,表明在骨肉瘤細(xì)胞中普魯卡因可影響ERK、p38 MAPK、FAK的磷酸化過程。Y15是ERK/MAPK/FAK通路抑制劑,可通過抑制FAK磷酸化,進而影響ERK、p38 MAPK的磷酸化過程。本研究使用Y15處理Saos-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低,表明ERK/MAPK/FAK通路確實是Saos-2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的關(guān)鍵通路。在使用Y15處理基礎(chǔ)上,在使用普魯卡因處理Saos-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Saos-2細(xì)胞的存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)較單獨使用Y15處理無顯著變化,推測普魯卡因?qū)aos-2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲過程的影響可能是通過抑制ERK/MAPK/FAK通路激活發(fā)揮作用的。

綜上所述,普魯卡因可能通過抑制ERK/MAPK/FAK通路激活抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,這為普魯卡因用于臨床治療骨肉瘤患者奠定了理論基礎(chǔ)。但體外環(huán)境不能完全代表體內(nèi)環(huán)境,普魯卡因的抗骨肉瘤增殖、遷移、侵襲作用在動物體內(nèi)是否效果依舊還需進一步設(shè)計動物實驗驗證。