張 昆孫 洋翟所鍇楊 光

(淄博市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,山東 淄博 255200)

肺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤,我國肺癌發(fā)病率逐年上升,其主要類型包括小細胞肺癌與非小細胞肺癌,其中小細胞肺癌具有高度侵襲性及轉(zhuǎn)移能力,進而導(dǎo)致治療效果降低,針對小細胞肺癌晚期患者,臨床主要采用化療方式進行治療,但化療耐藥性是降低治療效果的重要原因,然而目前關(guān)于化療耐藥性發(fā)生機制尚未闡明[1-4]。長鏈非編碼RNA HOXA-AS3(lncRNA HOXA-AS3)在非小細胞肺癌細胞中表達水平升高,并可調(diào)控HOXA3表達從而增強細胞順鉑耐藥性[5]。生物信息學分析顯示微小RNA-340-5p(miR-340-5p)在結(jié)腸癌細胞中表達水平降低,lncRNA LINC00662通過競爭性結(jié)合miR-340-5p而降低其表達水平從而促進結(jié)腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。因此,本研究采用順鉑濃度遞增法建立小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株,探究HOXAAS3對DMS114/DDP細胞增殖、凋亡的影響及其對miR-340-5p的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人小細胞肺癌細胞DMS114購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 組織材料

肺癌組織及癌旁組織:選取2017年1月至2019年1月本院收治的30例肺癌患者為研究對象,所有患者均經(jīng)手術(shù)、穿刺活檢或支氣管鏡活檢證實為小細胞肺癌,術(shù)前均未接受放化療,其中男16例,女14例,年齡40～70歲,平均年齡(55.63±6.35)歲,術(shù)中切除肺癌組織及癌旁組織,置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(院字(2016)12號),所有患者知情且簽署同意書。

1.2 主要試劑與儀器

順鉑購自上海華聯(lián)制藥公司;DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000、TRIzol試劑、qRT-PCR檢測試劑盒與cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;si-NC、si-HOXAAS3、miR-NC、miR-340-5p mimcs、anti-miR-NC、antimiR-340-5p購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;CCK-8檢測試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司;凋亡試劑盒購自美國Sigma公司;兔抗人CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

建立DMS114/DDP細胞:采用順鉑濃度遞增的方法建立耐藥細胞系,從低濃度的順鉑開始處理DMS114細胞,培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)液,更換不含藥物的培養(yǎng)液,每隔2 d更換1次培養(yǎng)液,待細胞恢復(fù)生長后增加順鉑劑量,繼續(xù)處理DMS114細胞,直至順鉑濃度為0.5 mg/L,細胞可穩(wěn)定生長,成功構(gòu)建耐藥細胞DMS114/DDP細胞[7]。DMS114細胞常規(guī)培養(yǎng),每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期DMS114/DDP細胞,分別將si-NC、si-HOXA-AS3、si-HOXA-AS3與anti-miR-NC、si-HOXA-AS3與antimiR-340-5p轉(zhuǎn)染至DMS114/DDP細胞,分別記作si-NC組、si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miRNC組、si-HOXA-AS3+anti-miR-340-5p組。

1.3.2 qRT-PCR檢測HOXA-AS3、miR-340-5p的表達水平

采用TRIzol法提取癌旁組織、肺癌組織、DMS114細胞、DMS114/DDP細胞及各組轉(zhuǎn)染后的DMS114/DDP細胞總RNA,將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(yīng),應(yīng)用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測HOXA-AS3、miR-340-5p相對表達量。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞存活率及IC50值

取DMS114細胞、DMS114/DDP細胞接種于96孔板(1×104個/孔),采用不同濃度(5、15、30、45、60 μmol/L)的順鉑處理細胞24 h[8],加入CCK-8溶液10 μL后培養(yǎng)2 h,檢測光密度值(OD值)。應(yīng)用Msvbvm50軟件計算細胞抑制率為50%時的順鉑濃度即順鉑IC50值。各組DMS114/DDP細胞于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時加入CCK-8溶液10 μL后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,檢測OD值。

1.3.4 檢測細胞凋亡率

取各組DMS114/DDP細胞,采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,將預(yù)冷PBS加入各組DMS114/DDP細胞后棄上清,細胞沉淀中加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞,按照試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因檢測HOXA-AS3與miR-340-5p的靶向關(guān)系

LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示HOXA-AS3與miR-340-5p存在結(jié)合位點,分別構(gòu)建野生型載體WT-HOXA-AS3與突變型載體MUT-HOXA-AS3,分別將miR-NC、miR-340-5p mimics與WT-HOXAAS3、MUT-HOXA-AS3共轉(zhuǎn)染至DMS114/DDP細胞后檢測細胞熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot檢測CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達

DMS114/DDP細胞加入RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入一抗稀釋液(1∶1000)與二抗稀釋液(1∶5000),室溫孵育1 h,ECL顯影,應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA HOXA-AS3和miR-340-5p在肺癌組織中的表達

與癌旁組織比較,肺癌組織中HOXA-AS3的表達水平升高(P＜0.05),miR-340-5p的表達水平降低(P＜0.05),見圖1。

圖1 lncRNA HOXA-AS3和miR-340-5p在肺癌組織中的表達(±s,n=30)Note.Compared with para-carcinoma tissue,*P＜0.05.Figure 1 Expression of lncRNA HOXA-AS3 and miR-340-5p in lung cancer tissues

2.2 順鉑對小細胞肺癌DMS114和DMS114/DDP細胞活性的影響

與對照組比較,不同濃度的順鉑處理后DMS114細胞、DMS114/DDP細胞存活率逐漸降低(P＜0.05),且DMS114/DDP細胞存活率高于DMS114細胞;與DMS114細胞比較,DMS114/DDP細胞IC50值升高(P＜0.05),見圖2。

圖2 順鉑對小細胞肺癌DMS114和DMS114/DDP細胞存活率的影響(±s,n=9)Note.Compared with the Control group,*P＜0.05.Compared with DMS114,#P＜0.05.Figure 2 Effect of cisplatin on the survival rate of small cell lung cancer DMS114 and DMS114/DDP cells

2.3 lncRNA HOXA-AS3在DMS114和DMS114/DDP細胞中的表達

與DMS114細胞比較,DMS114/DDP細胞中HOXA-AS3的表達水平升高(P＜0.05),見圖3。

圖3 lncRNAHOXA-AS3在DMS114和DMS114/DDP細胞中的表達(±s,n=9)Note.Compared with DMS114,*P＜0.05.Figure 3 Expression of lncRNAHOXA-AS3 in DMS114 and DMS114/DDP cells

2.4 干擾lncRNA HOXA-AS3對DMS114/DDP細胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較,轉(zhuǎn)染si-HOXA-AS3后細胞活力降低(P＜0.05),并可提高凋亡率及p21、Bax蛋白水平(P＜0.05),降低CyclinD1、Bcl-2蛋白水平(P＜0.05),見圖4。

2.5 lncRNA HOXA-AS3靶向調(diào)控miR-340-5p的表達

LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示HOXA-AS3與miR-340-5p存在結(jié)合位點,見圖5A。miR-340-5p過表達可降低WT-HOXA-AS3的熒光素酶活性(P＜0.05),而對MUT-HOXA-AS3熒光素酶活 性 無 明 顯 影 響(P＞0.05),見圖5B。與pcDNA組比較,pcDNA-HOXA-AS3組miR-340-5p的表達水平降低(P＜0.05);與si-NC組比較,si-HOXA-AS3組miR-340-5p的 表 達 水 平 升 高(P＜0.05),見圖5C。

圖5 lncRNA HOXA-AS3靶向調(diào)控miR-340-5p的表達(ˉx±s,n=9)Note.A,Sequence of lncRNA HOXA-AS3 contains a nucleotide sequence complementary to miR-340-5p.B,Double luciferase report experiment.C,lncRNA HOXA-AS3 regulated the expression of miR-340-5p.Compared with miR-NC group,*P＜0.05.Compared with pcDNA group,#P＜0.05.Compared with si-NC group,&P＜0.05.Figure 5 lncRNA HOXA-AS3 targeted the expression of miR-340-5p

2.6 抑制miR-340-5p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA HOXAAS3對DMS114/DDP增殖和凋亡的影響

與si-HOXA-AS3+anti-miR-NC組比較,共轉(zhuǎn)染si-HOXA-AS3+anti-miR-340-5p后細胞活力升高(P＜0.05),并可降低凋亡率及p21、Bax蛋白水平(P＜0.05),提高CyclinD1、Bcl-2蛋白水平(P＜0.05),見圖6。

圖6 抑制miR-340-5p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA HOXA-AS3對DMS114/DDP增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Note.A,Expression level of miR-340-5p.B,Cell proliferation.C,D,Cell apoptosis.E,F,Expression of proliferation and apoptosis-related proteins.Compared with si-HOXA-AS3+anti-miR-NC group,*P＜0.05.Figure 6 Inhibition of miR-340-5p could reverse the effect of interference lncRNA HOXA-AS3 on DMS114/DDP cell proliferation and apoptosis

3 討論

小細胞肺癌具有惡性程度高、生存期短特點,主要治療方式為化療,治療早期患者放化療敏感性較高,但隨著治療時間的延長,患者出現(xiàn)放化療抵抗而導(dǎo)致治療失敗,因而逆轉(zhuǎn)小細胞肺癌耐藥性已成為亟待解決的問題。研究表明LncRNA可通過競爭性結(jié)合miRNA,進而在肺癌順鉑耐藥性中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9-11]。提示LncRNA可能作為逆轉(zhuǎn)小細胞肺癌耐藥性的潛在靶點。

HOXA-AS3在肝細胞癌中的表達水平升高,并可充當miR-29c的海綿分子,進而促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移[12]。HOXA-AS3在肺癌細胞中表達水平升高,并可促進細胞增殖[13]。但HOXA-AS3在肺癌發(fā)生及發(fā)展中的分子機制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示肺癌組織及細胞中HOXA-AS3的表達水平明顯升高,順鉑耐藥性細胞中HOXA-AS3的表達水平明顯高于正常肺癌細胞,提示HOXA-AS3在DMS114/DDP細胞中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示干擾HOXA-AS3表達后順鉑耐藥細胞增殖能力減弱,凋亡率升高,并可降低CyclinD1、Bcl-2的表達及促進p21、Bax的表達。既往研究表明CyclinD1、p21表達異常與細胞增殖密切相關(guān),CyclinD1在腫瘤中表達水平升高,并可調(diào)控細胞周期,促進細胞增殖,而p21的作用與之相反[14]。Bcl-2/Bax比值失衡可促進或抑制細胞凋亡,其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,Bax屬于促細胞凋亡蛋白[15]。本研究結(jié)果顯示干擾HOXA-AS3表達可抑制DMS114/DDP細胞增殖及促進細胞凋亡進而提高細胞順鉑敏感性。

miR-340-5p表達異常可通過抑制BMP4而促進甲狀腺癌的進展[16]。miR-340-5p在肺癌細胞中表達下調(diào),上調(diào)其表達可抑制肺癌細胞增殖及侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示,miR-340-5p在肺癌中呈低表達,HOXA-AS3可靶向結(jié)合miR-340-5p,抑制miR-340-5p表達可明顯逆轉(zhuǎn)干擾HOXA-AS3對細胞增殖、凋亡的作用。

綜上所述,干擾HOXA-AS3表達可抑制細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡進而提高DMS114/DDP細胞順鉑敏感性,其作用機制可能與上調(diào)miR-340-5p的表達有關(guān),其可能作為逆轉(zhuǎn)小細胞肺癌順鉑耐藥性的潛在靶點,但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。