劉 瑋宗佩君許婷婷*

(1.濰坊護理職業(yè)學院病理教研室,山東 濰坊 262500;2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院病理科,山東 濰坊 262500)

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是口腔最常見的惡性腫瘤之一,占口腔腫瘤的90%以上。它對人類的生命和健康構(gòu)成了嚴重的威脅。盡管在治療方面取得了許多進展,包括根治性手術(shù)、放療和新輔助化療,但TSCC仍與不良預后相關(guān)。由于局部侵襲性強、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高,患者5年生存率僅為50%左右[1]。因此,探討腫瘤的作用機制、尋找更有效的治療策略非常重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一種近期發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中具有重要調(diào)控作用因子[2]。前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(prostate cancer-associated transcript 1,PCAT1)是其中之一,這是近2年新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA。顧名思義,PCAT1是首先在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的,其在喉癌、子宮內(nèi)膜癌中均發(fā)揮促進癌癥惡化作用[3-5]。但PCAT1在舌鱗狀細胞癌中的表達及其可能作用機制尚未可知,本研究旨在探究PCAT1在TSCC中的功能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人正?？谇唤琴|(zhì)細胞NHOK、人舌鱗狀細胞癌細胞UM1、CAL-27、SCC25均購自美國模式培養(yǎng)物保存所。

1.1.2 材料

35例TSCC組織及匹配的癌旁組織來自本醫(yī)院2018年2月～2020年6月期間接受TSCC手術(shù)切除的患者?；颊呋蚱浼覍倬炇鹬橥鈺?。

1.2 主要試劑與儀器

人谷氨酸鹽(glutamate)ELISA檢測試劑盒購自上?？ㄅ锟萍加邢薰?α-酮戊二酸(αketoglutarate,α-KG)檢測試劑盒購自Abcam;細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit,CCK-8)購自日本同仁化學研究中心;實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)購自日本TaKaRa;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物研究所;實驗中的質(zhì)粒、DNA和引物均由深圳默賽爾生物醫(yī)學發(fā)展公司設(shè)計合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

NHOK、UM1、CAL-27、SCC25細胞的培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)液均為DMEM培養(yǎng)基(含有15%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液)。培養(yǎng)條件為:37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.3.2 分組

將收集的TSCC組織標記為癌組織組,癌旁組織標記為癌旁組織組;將正常培養(yǎng)的NHOK、UM1、CAL-27、SCC25細胞分別標記為NHOK組、UM1組、CAL-27組、SCC25組;用3倍質(zhì)粒或DNA量的脂質(zhì)體將質(zhì)?；駾NA轉(zhuǎn)染至UM1細胞,具體為香江脂質(zhì)體和質(zhì)?；駾NA混合,再將混合液與UM1細胞共培養(yǎng)8 h,添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,再用qRTPCR檢測轉(zhuǎn)染的效率。各組細胞所轉(zhuǎn)染的質(zhì)?；駾NA為pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-PCAT1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-PCAT1)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-329-3p組(轉(zhuǎn)染miR-329-3p mimics)、pcDNAPCAT1+miR-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA-PCAT1和miRNC)、pcDNA-PCAT1+miR-329-3p組(共 轉(zhuǎn) 染pcDNA-PCAT1和miR-329-3p mimics)。

1.3.3 qRT-PCR檢測PCAT1、miR-329-3p表達

將需要檢測的細胞提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為模板放置在-20℃保存?zhèn)溆?。用qRTPCR試劑盒檢測模板中PCAT1、miR-329-3p表達。結(jié)果以GAPDH、U6為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計算PCAT1、miR-329-3p的相對表達水平。PCAT1,上游引物5’-TGAGAAGAGAAATCTATTGGAACC-3’,下游引物5’-GGTTTGTCTCCGCTGCTTTa-3’;GAPDH,上游引物5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’,下游引物5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATa-3’;miR-329-3p上游引物5’-GGGAACACACCTGGTTAAC-3’,下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.3.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖率

將需要檢測的細胞調(diào)整至每毫升105個,取其中100 μL置于24孔板,按照CCK-8試劑盒要求操作添加反應液,在490 nm波長下檢測細胞吸光值(A)。細胞增殖率為A實驗組/A對照組×100%。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲

將需要檢測的細胞先用不含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h,調(diào)整至每毫升5×104個。取100 μL細胞浸潤小室上表面的膜,再去600 μL含血清的培養(yǎng)液置于下室,將小室移至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。結(jié)束后去除殘余的細胞,將膜進行固定和染色,并將膜的上表面朝上封片。用顯微鏡進行鏡檢,觀察細胞的數(shù)量,計數(shù),取平均數(shù)。

1.3.6 ELISA實驗檢測谷氨酸鹽、α-KG水平

收集需要檢測的細胞上清液,按人谷氨酸鹽(glutamate)ELISA檢測試劑盒、α-酮戊二酸(α-KG)檢測試劑盒要求操作,測定其中谷氨酸鹽、α-KG的水平。結(jié)果以相對應的對照組水平為單位1,計算檢測組細胞上清中谷氨酸鹽、α-KG的水平。

1.3.7 生物信息學預測

使用生物信息學在線預測網(wǎng)站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)分析PCAT1與miR-329-3p之間是否存在結(jié)合位點。

1.3.8 雙熒光素酶報告實驗驗證PCAT1靶向miR-329-3p

根據(jù)預測到的PCAT1結(jié)合位點用化學合成野生型PCAT1基因片段(含有結(jié)合位點)和突變型PCAT1基因片段(不含結(jié)合位點),并將其克隆至熒光載體psiCHECK2構(gòu)建熒光素酶報告基因,并提取質(zhì)粒。用脂質(zhì)體將其與miR-NC、miR-329-3p共轉(zhuǎn)染至UM1。用雙熒光素酶報告實驗試劑盒檢測細胞中螢火蟲、海腎的熒光活性,結(jié)果以螢火蟲熒光活性與海腎熒光活性之比表示PCAT1與miR-329-3p之間結(jié)合。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 PCAT1、miR-329-3p在TSCC中的表達

與癌旁組織組相比,癌組織組PCAT1表達明顯上調(diào),miR-329-3p表達明顯下調(diào)(P＜0.05);與NHOK組相比,UM1、CAL-27、SCC25細胞中PCAT1表達均上調(diào),miR-329-3p表達均下調(diào)(P＜0.05),其中UM1細胞中PCAT1的表達水平相對較高,因而選用UM1細胞進行后續(xù)研究(表1、表2)。

表1 TSCC組織中PCAT1、miR-329-3p的表達(±s,n=35)Table 1 Expression of PCAT1 and miR-329-3p in TSCC

表1 TSCC組織中PCAT1、miR-329-3p的表達(±s,n=35)Table 1 Expression of PCAT1 and miR-329-3p in TSCC

注:與癌旁組織組相比,*P＜0.05。Note.Compared with the adjacent tissue group,*P＜0.05.

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表2 TSCC細胞中PCAT1、miR-329-3p的表達(±s,n=9)Table 2 Expression of PCAT1 and miR-329-3p in TSCC cells

表2 TSCC細胞中PCAT1、miR-329-3p的表達(±s,n=9)Table 2 Expression of PCAT1 and miR-329-3p in TSCC cells

注:與NHOK組相比,*P＜0.05。Note.Compared with the NHOK group,*P＜0.05.

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2.2 PCAT1對TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解的影響

與pcDNA組相比,pcDNA-PCAT1組PCAT1表達明顯上升,細胞增殖率、細胞侵襲數(shù)和細胞侵襲數(shù)均發(fā)生上調(diào),谷氨酸鹽水平和α-KG水平也發(fā)生明顯升高(P＜0.05,表3)。

表3 過表達PCAT1的TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解情況(±s,n=9)Table 3 Proliferation,migration,invasion and glutamine decomposition of TSCC cells overexpressing PCAT1

表3 過表達PCAT1的TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解情況(±s,n=9)Table 3 Proliferation,migration,invasion and glutamine decomposition of TSCC cells overexpressing PCAT1

注:與pcDNA組相比,*P＜0.05。Note.Compared with pcDNA group,*P＜0.05.

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2.3 PCAT1靶向miR-329-3p

通過生物信息學在線預測網(wǎng)站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預測到PCAT1與miR-329-3p之間存在互補的結(jié)合位點(圖1)。與miR-NC組相比,miR-329-3p組WT-PCAT1細胞的熒光活性明顯降低,miR-329-3p組UM1細胞PCAT1表達顯著降低(P＜0.05)(表4、圖2)。

表4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果及miR-329-3p的表達(±s,n=9)Table 4 Experimental results of dual luciferase reporter gene and expression of miR-329-3p

表4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果及miR-329-3p的表達(±s,n=9)Table 4 Experimental results of dual luciferase reporter gene and expression of miR-329-3p

注:與miR-NC組相比,*P＜0.05。Note.Compared with miR-NC group,*P＜0.05.

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圖1 PCAT1與miR-329-3p之間的互補核苷酸序列Figure 1 Complementary nucleotide sequence between PCAT1 and miR-329-3p

圖2 熒光素酶報告實驗檢測熒光活性Figure 2 Luciferase reporter assay was used to detect the fluorescence activity

2.4 miR-329-3p對TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解的影響

與miR-NC組相比,miR-329-3p組TSCC細胞miR-329-3p表達顯著升高,細胞增殖率、細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)均顯著降低,谷氨酸鹽水平和α-KG水平均明顯降低(P＜0.05,表5)。

表5 過表達miR-329-3p對TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解的影響(±s,n=9)Table 5 Effects of overexpression of miR-329-3p on TSCC cell proliferation,migration,invasion and glutamine breakdown

表5 過表達miR-329-3p對TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解的影響(±s,n=9)Table 5 Effects of overexpression of miR-329-3p on TSCC cell proliferation,migration,invasion and glutamine breakdown

注:與miR-NC組相比,*P＜0.05。Note.Compared with miR-NC group,*P＜0.05.

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2.5 miR-329-3p對PCAT1在TSCC細胞調(diào)控作用的回復

與pcDNA-PCAT1+miR-NC組比,pcDNA-PCAT1+miR-329-3p組PCAT1表達顯著降低,細胞增殖率。遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯降低,谷氨酸鹽水平和α-KG水平也顯著下調(diào)(P＜0.05,表6)。

表6 miR-329-3p對PCAT1在TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解作用的影響(±s,n=9)Table 6 Effects of miR-329-3p on the proliferation,migration,invasion and glutamine breakdown of PCAT1 in TSCC cells

表6 miR-329-3p對PCAT1在TSCC細胞增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解作用的影響(±s,n=9)Table 6 Effects of miR-329-3p on the proliferation,migration,invasion and glutamine breakdown of PCAT1 in TSCC cells

注:與pcDNA-PCAT1+miR-NC組相比,*P＜0.05。Note.Compared with pcDNA-PCAT1+miR-NC group,*P＜0.05.

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3 討論

PCAT1在人類的多種癌癥中均表現(xiàn)出促進癌癥惡化的作用[6-7],但是其在TSCC中是否也具有相同的促進癌癥惡化作用有待探究。Huang等[8]在研究中報道,PCAT1在食道鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織和細胞中的表達明顯升高,下調(diào)PCAT1抑制ESCC細胞的增殖。PCAT1通過調(diào)節(jié)PHLPP/FKBP51/IKKα復合物激活AKT/NF-κB信號傳導而促進去勢抵抗性前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展[9]。PCAT1通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)肝外膽管癌的進展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)PCAT1在TSCC組織和癌細胞中的表達均顯著上調(diào),并且過表達PCAT1促進癌細胞的增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解,提示PCAT1在TCSS中發(fā)揮促進癌癥惡化的作用。谷氨酰胺是一種具有胺官能團的非必需氨基酸,是血液中循環(huán)最豐富的氨基酸。賴谷氨酰胺分解一直被認為是癌細胞代謝的一個標志。與正常分化的細胞不同,癌細胞已經(jīng)重新編程了新陳代謝,以滿足其能量需求。許多代謝途徑癌在細胞的能量獲取中占據(jù)重要地位,如葡萄糖轉(zhuǎn)運,包括谷氨酰胺分解和磷酸戊糖途徑[11-12]。谷氨酰胺分解產(chǎn)物谷氨酸鹽、α-酮戊二酸(α-KG)是谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵產(chǎn)物,本研究發(fā)現(xiàn)過表達PCAT1能夠上調(diào)谷氨酸鹽、α-KG的含量。

本研究還發(fā)現(xiàn),PCAT1能夠吸附miR-329-3p,推測這可能與PCAT1在TSCC中的功能有聯(lián)系。據(jù)報道,大量miRNA在TSCC中表達失調(diào)[13-14],但是仍有新發(fā)現(xiàn)的miRNA在TSCC中的功能尚未清楚。Chang等[15]報道,miR-329-3p在胃癌組織中的表達水平明顯下調(diào),并且與患者的淋巴轉(zhuǎn)移、分期和總生存期呈負相關(guān),表明miR-329-3p的下調(diào)與胃癌患者的預后不良有關(guān)。Li等[16]發(fā)現(xiàn),miR-329-3p在宮頸癌組織和細胞系中的表達水平均降低,miR-329-3p低表達與宮頸癌患者的組織學分級、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。miR-329-3p的上調(diào)能夠抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。并且MAPK1為miR-329-3p的直接靶基因,揭示了miR-329-3p通過直接靶向MAPK1發(fā)揮腫瘤抑制作用,推測其可作為治療宮頸癌患者的新型治療靶標。miR-329-3p/ADP核糖基化因子1(ARF1)通路可作為腫瘤蛋白P73反義RNA 1(TP73-AS1)的下游吸附因子,參與TP73-AS1在宮頸癌中的致癌作用[17]。此研究發(fā)現(xiàn),miR-329-3p在TSCC組織和癌細胞中的表達異常下調(diào),進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-329-3p能夠抑制癌細胞的增殖、遷移侵襲和谷氨酰胺分解,這說明miR-329-3p在TSCC中具有抑制癌癥發(fā)生惡化的作用。過表達miR-329-3p還能夠減弱PCAT1對TSCC癌細胞惡化的促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-329-3p則可以抑制谷氨酸鹽、α-KG,提示PCAT1、miR-329-3p能夠通過谷氨酰胺分解調(diào)節(jié)TSCC的進展。

綜上所述,PCAT1在TSCC中高表達,miR-329-3p在TSCC中低表達,PCAT1可通過靶向調(diào)控miR-329-3p的表達而促進TSCC細胞增殖、遷移和侵襲,其可能作為TSCC治療的潛在靶標,還可為進一步闡釋TSCC的發(fā)病機制奠定實驗基礎(chǔ)。