血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑對(duì)早期糖尿病腎病患者尿液中足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、自噬基因Beclin-1 mRNA排泄的影響

劉倫志, 鄧 璐, 張明霞

(湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院 腎內(nèi)科 湖北省腎臟病臨床研究中心 風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 恩施 445000)

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì)在全國31個(gè)省進(jìn)行的糖尿病的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國18歲及以上人群糖尿病患病率約為11.2%[1]，其中約有20%～40%的糖尿病患者可能出現(xiàn)糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)[2]。DN已經(jīng)成為慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)和終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)最主要的的病因之一[3]。在西方國家，DN已成為ESRD的第一大病因[4]。根據(jù)中國腎臟病數(shù)據(jù)系統(tǒng)全國血液透析病例信息登記信息數(shù)據(jù)，2019年底我國血液透析患者約63萬人，其中DN患者數(shù)居第二位，且近10年來發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，從2011年的15.1%上升至2019年的19.4%[5]。早期DN的診治在慢性病的防治中有著重要的意義。足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵的作用[6]，雖然腎穿刺活檢已經(jīng)廣泛普及，但由于有創(chuàng)性，糖尿病患者對(duì)其接受程度不高，導(dǎo)致早期DN患者在病理水平的研究較為困難。在DN發(fā)展過程中，患者足細(xì)胞在高糖、氧化應(yīng)激、自噬等損傷因素作用下其結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生改變，部分足細(xì)胞錨鏈蛋白缺失、凋亡、脫落而隨尿液排出體外。檢測(cè)尿液中足細(xì)胞相關(guān)蛋白或基因就成為一個(gè)無創(chuàng)地了解足細(xì)胞損傷的措施[7]。本研究旨在探討血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)氯沙坦對(duì)早期DN患者尿液足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin、自噬基因Beclin 1 mRNA排泄的影響，探討足細(xì)胞的損傷機(jī)制及ARB的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2018年1月-2021年1月于我院確診資料完整的2型糖尿病患者48例為DN組。選取同期年齡匹配的健康志愿者30例為對(duì)照組。DN組男26例，女22例，對(duì)照組男16例，女14例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DN組39～79歲，平均(55.7±16.3)歲, 對(duì)照組34～71歲，平均(51.3±19.5)歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)論證批準(zhǔn)。

1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn) 符合早期DN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，3～6個(gè)月重復(fù)尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin creatinine ratio，UACR)為30～300 mg/g，腎功能測(cè)定內(nèi)生肌酐清除率在60 ml/min以上，均用胰島素控制血糖且達(dá)標(biāo)。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①有其他原發(fā)或者繼發(fā)腎臟疾病，如急慢性腎炎，腎病綜合征，IgA 腎病，過敏性紫癜腎炎，免疫性疾病腎損害，惡性腫瘤等疾?。虎谀蚵犯腥?；③內(nèi)生肌酐清除率小于60 ml/min；④大量蛋白尿；⑤血糖控制不良；⑥正在或3個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting-enzyme inhibitors, ACEI)或ARB類藥物；⑦對(duì)氯沙坦及其輔料過敏。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 兔抗大鼠Podocalyxin多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(均購自Santa Cruz)，Trizol試劑盒(Invitrogen)，Rt-PCR試劑盒(Invitrogen)，nephrin及Beclin-1引物(天工生物合成)，倒置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(IX71，奧林巴斯)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Ligh-tCycler 480)。

1.2.2治療 DN組給予氯沙坦50 mg/d (杭州默沙東制藥)治療，監(jiān)測(cè)患者血壓、腎功能、血電解質(zhì)，如能耐受，逐漸加至100 mg/d。觀察時(shí)間為6個(gè)月。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1尿液及生化指標(biāo) 所有納入觀察的病例均常規(guī)查肝腎功能、血糖、血脂、血尿酸、血常規(guī)、糖化血紅蛋白，檢測(cè)尿液中微量白蛋白，24小時(shí)尿蛋白定量；收集晨尿100 ml， 30分鐘內(nèi)離心后免疫熒光檢查尿液足細(xì)胞排泄個(gè)數(shù)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)尿液中 nephrin，Beclin-1 mRNA 表達(dá)。

1.3.2尿液足細(xì)胞排泄個(gè)數(shù) 取新鮮晨尿100 ml，離心5 min(1 500 r/min)，取離心尿沉渣100 μl混勻，倒置顯微鏡仔細(xì)觀察，如尿沉渣有單個(gè)核細(xì)胞者, 取沉渣50 μl置于自動(dòng)涂片離心機(jī)、離心2 min(1 200 r/min), 加丙酮于4 ℃固定, 室溫干燥。將涂片置于PBS浸泡濕潤, 用1% BSA封閉，滴加兔抗Podocalyxin多克隆抗體，4 ℃孵育，對(duì)照滴加PBS，然后滴加FITC標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，加入碘化丙啶0.25 μg/ml于標(biāo)本上復(fù)染細(xì)胞核, 室溫下避光孵育5 min, PBS 漂洗, 50%甘油封片, 熒光顯微鏡580 nm波長觀察，顯微鏡下類圓形綠色有核染者為足細(xì)胞。選取20個(gè)連續(xù)不重疊高倍顯微鏡下足細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè)/20個(gè)視野)。

1.3.3尿液中nephrin、Beclin-1mRNA表達(dá) 收集新鮮晨尿100 ml，為盡量減少RNA酶的分解，于30分鐘內(nèi)迅速離心(1 500 r/min，5 min)，丟棄上清液，采用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm檢測(cè)樣品OD值，根據(jù)A260/280的比值來判斷RNA樣本純度，如果其比值為1.8～2.0表示樣本RNA合格。nephrin上游引物為5′-CGGAGAAGACTGAGGCGC-3′，下游引物為5′-TCACACCAGATGTCCCTCAG-3′，產(chǎn)物為459 bp；Beclin-1上游引物為5′-GGGGGTTGCGGTTTTTCTGGGA-3′，下游引物為5′-CTTGCCTTTCTCCACATCCTCCTG-3′，產(chǎn)物為95 bp。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以βactin為內(nèi)參照，每個(gè)樣本重復(fù)3次取平均值。nephrin預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環(huán)30次，終延伸72 ℃ 10 min，最終反應(yīng)體系為25 μl。Beclin-1預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 60 s，循環(huán)40次。采用2△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△CtDN組-△Ct對(duì)照組。

2 結(jié) 果

2.1生化指標(biāo)比較 對(duì)照組空腹血糖、膽固醇低于DN組(均P<0.01)，而DN組治療前后空腹血糖、膽固醇比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。對(duì)照組與DN組、DN組治療前后的血漿白蛋白和血肌酐比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1～2。

表1 兩組生化指標(biāo)比較

表2 DN組治療前后生化指標(biāo)變化

2.2UACR及足細(xì)胞排泄比較 DN組UACR與對(duì)照組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，給予氯沙坦治療6個(gè)月后DN組UACR有一定程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)；對(duì)照組尿液中很難檢測(cè)到足細(xì)胞，而早期DN患者尿液足細(xì)胞排泄增加明顯(P<0.01)。應(yīng)用氯沙坦治療6個(gè)月后， DN組足細(xì)胞排泄減少(P=0.038)。見表3～4。

表3 兩組尿液足細(xì)胞排泄及UACR比較

2.3DN組尿液中nephrin、Beclin-1 mRNA排泄情況 對(duì)照組尿液中nephrin、Beclin-1 mRNA十分微量難以檢出，DN組在應(yīng)用氯沙坦治療后尿液中nephrin、Beclin1 mRNA表達(dá)呈不同的變化趨勢(shì)， nephrin mRNA表達(dá)較治療前明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)，尿液Beclin-1 mRNA排泄雖然總體呈上調(diào)趨勢(shì)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.067)，見表5。

表4 DN組治療前后尿液足細(xì)胞排泄及UACR比較

表5 DN組治療前后尿nephrin、Beclin-1 mRNA排泄

3 討 論

DN是嚴(yán)重危害身體健康及導(dǎo)致ESRD的重要疾病之一。全球目前有約3億糖尿病患者，其中約25%～40%發(fā)展為DN[9]，我國糖尿病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果與其基本一致。在DN的發(fā)病機(jī)制中，足細(xì)胞損傷的作用越來越受到重視，足細(xì)胞受損是DN發(fā)展的關(guān)鍵[10]。足細(xì)胞足突融合、裂孔隔膜損傷、足細(xì)胞過度凋亡、足細(xì)胞密度下降與DN的蛋白尿、腎小球硬化密切相關(guān)。因此，有學(xué)者認(rèn)為DN的本質(zhì)就是足細(xì)胞病[11]。

DN患者足細(xì)胞凋亡、錨鏈蛋白丟失，足細(xì)胞從基底膜上脫落。一方面基底膜裸露刺激纖維蛋白增生，導(dǎo)致腎小球不可逆硬化，另一方面脫落的足細(xì)胞可能出現(xiàn)在尿液中，同時(shí)其攜帶的足細(xì)胞相關(guān)蛋白也會(huì)出現(xiàn)在尿液中[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的激活可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，抑制RAS激活對(duì)足細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以延緩DN的進(jìn)展[14-15]。但是，這些研究多是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者體外研究，對(duì)于糖尿病患者的直接研究證據(jù)較少。在本研究中也發(fā)現(xiàn)正常健康人足細(xì)胞排泄很少，難以被檢測(cè)到，早期DN患者尿液中足細(xì)胞排泄明顯增加，尿液中足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin mRNA也同步增加，間接驗(yàn)證了足細(xì)胞受損脫落。而應(yīng)用氯沙坦后患者足細(xì)胞及足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin mRNA排泄減少，提示ARB能減少足細(xì)胞的脫落，對(duì)糖尿病患者足細(xì)胞具有保護(hù)作用。

自噬在糖尿病足細(xì)胞損傷過程中有著重要地位[16]。在RAS激活導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷過程中自噬也扮演著重要角色[17]。自噬是細(xì)胞通過一系列復(fù)雜機(jī)制降解自身受損的細(xì)胞器，是細(xì)胞自我更新的一種程序性死亡，以維持細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)。正常情況下，足細(xì)胞由于代謝的活躍及所處的特殊地位容易受到損傷，其基礎(chǔ)自噬相當(dāng)活躍，其代表自噬活性的LC3、Beclin-1通常表達(dá)豐富[18]。由于糖尿病患者細(xì)胞能量過度，足細(xì)胞會(huì)下調(diào)自噬水平，同時(shí)由于DN患者足細(xì)胞暴露的損傷及應(yīng)激因素顯著增加，對(duì)自噬的保護(hù)性需求增加，這種自噬水平下降和需求增加之間的矛盾會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞老化、細(xì)胞損傷、功能障礙，最終加速DN的病理生理過程[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)尿液中代表自噬活性的Beclin-1 mRNA水平在正常人難以檢測(cè)出，可能與健康人足細(xì)胞隨尿液脫落排出很少有關(guān)，早期DN患者尿液中Beclin-1 mRNA呈低水平表達(dá)，應(yīng)用氯沙坦后雖然尿液中檢出的足細(xì)胞排泄減少，但尿液中Beclin-1 mRNA水平反而升高，說明單個(gè)足細(xì)胞中Beclin-1 mRNA表達(dá)水平是有所提高的，提示ARB可能通過提高DN患者足細(xì)胞自噬水平達(dá)到保護(hù)作用。

綜上，對(duì)早期DN患者及時(shí)應(yīng)用ARB，減少尿微量白蛋白排泄，保護(hù)足細(xì)胞，并可能增強(qiáng)足細(xì)胞自噬作用，使之收益。