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      糞腸球菌內(nèi)源性質(zhì)粒的序列分析及其穿梭載體的構(gòu)建

      2021-12-16 02:21:20郭建軍魏國汶
      食品工業(yè)科技 2021年23期
      關(guān)鍵詞:糞腸拷貝數(shù)球菌

      袁 林,曾 靜,郭建軍,魏國汶

      (江西省科學(xué)院微生物研究所, 江西南昌 330096)

      乳酸菌是一群革蘭氏陽性、能夠發(fā)酵碳水化合物、以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的各類細菌統(tǒng)稱,是人與大多數(shù)動物腸道內(nèi)的常見優(yōu)勢菌群[1?5]。乳酸菌被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)以及飼料工業(yè)等,是全世界公認(rèn)的安全級(Generally Recognized as Safe, GRAS)食品微生物,并逐漸成為微生物學(xué)研究的模式生物[6]?,F(xiàn)階段研究與開發(fā)乳酸菌食品級載體-受體系統(tǒng),探索重要基因在乳酸菌中的克隆表達,已成為乳酸菌分子生物學(xué)研究的熱點[7?11]。

      質(zhì)粒是細菌細胞中染色體之外,能夠自主復(fù)制的共價閉合環(huán)狀雙螺旋的DNA分子或遺傳因子。已有研究表明,乳酸菌可攜帶數(shù)個質(zhì)粒,大小不一,其中多數(shù)質(zhì)粒為隱蔽性質(zhì)粒,少數(shù)質(zhì)粒則具有某些特殊功能[12]。乳酸菌的一些特性與其所攜帶的質(zhì)粒相關(guān),并且這些特性可以通過質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至其他乳酸菌或其他細菌中[13]。目前已有許多研究對乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒進行序列測定和功能分析,并利用乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒上重要元件構(gòu)建乳酸菌載體,其中獲得乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒的復(fù)制子是構(gòu)建乳酸菌載體的關(guān)鍵[14?16]。例如,F(xiàn)ang 等[17]對來源于植物乳桿菌Lactobacillus plantarumLP3的質(zhì)粒pLP3進行分離及測序分析,并基于質(zhì)粒pLP3的復(fù)制子成功構(gòu)建乳酸菌表達載體;Zuo等[18]對來源于糞腸球菌Enterococcus faecalisML21的高拷貝數(shù)質(zhì)粒pML21進行分離及測序分析,然后采用分子生物學(xué)技術(shù)將質(zhì)粒pML21的復(fù)制子與大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體pAM1上包含紅霉素抗性基因Em和大腸桿菌復(fù)制子的DNA片段相融合,獲得了大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體。

      本研究從本實驗室前期分離純化的具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌Enterococcus faecalisEXW27中分離得到了內(nèi)源性質(zhì)粒pXW,擬對其進行DNA序列的測定及分析,確定質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子,然后利用質(zhì)粒pXW的復(fù)制子構(gòu)建大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體,并研究大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性。本研究所涉及的糞腸球菌E.faecalisEXW27的內(nèi)源性質(zhì)粒pXW可以為乳酸菌基因操作提供新工具,并可以為構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌表達載體提供基礎(chǔ)元件。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      大腸桿菌Escherichia coliDH5α、糞腸球菌E.faecalisEXW27、乳脂乳球菌LactococcuscremorisMG1363、乳酸乳球菌乳酸亞種Lactococcus lactissubsp.lactisLM0230、嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilusXW118、植物乳桿菌Lactiplantibacillus plantarumXW113、鼠李糖乳桿菌Lacticaseibacillus rhamnosusDB、副干酪乳桿菌Lacticaseibacillus paracaseiLG1、乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiXW28 均由本實驗室保存;KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司;DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒 日本Takara公司;MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司;實驗所用試劑 均為分析純。

      PCR 儀 (Mastercycler gradient) 美國 Eppendorf公司;QuantStudio 實時熒光定量 PCR 儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司;TY04S-3C 凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SP-752PC 紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 引物設(shè)計與合成 大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建過程中以及糞腸球菌內(nèi)源性質(zhì)??截悢?shù)測定過程中涉及的引物及其序列見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

      表1 引物信息Table 1 Primer sequences

      1.2.2 質(zhì)粒的提取與序列測定 挑取MRS平板上單菌落,接種于100 mL新鮮的 MRS 液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的MRS 液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。8000 g離心10 min收集菌體,首先用10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA,pH8.0 緩沖液洗滌菌體沉淀,然后用含有30 mg/mL溶菌酶溶液(10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA,pH8.0)重新懸浮菌體,并于 37 ℃處理1 h,最后采用 Takara 質(zhì)粒 DNA 小量純化試劑盒提取質(zhì)粒。利用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)所提取質(zhì)粒的大小,并將分離純化的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

      1.2.3 質(zhì)粒的序列分析及注釋 將測序完成的DNA 序列用 SnapGene Viewer(version 2.3.2)軟件進行人工拼接,繪制質(zhì)粒圖譜,標(biāo)注重要酶切位點并分析質(zhì)粒DNA序列中的G+C含量。采用NCBI網(wǎng)站的 ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找質(zhì)粒的開放閱讀框(open reading frame,ORF),結(jié)合質(zhì)粒啟動子預(yù)測網(wǎng)站Promoter Pridition(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)確定各開放閱讀框的啟動子序列。采用NCBI網(wǎng)站的 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.ov/Blast.cgi)對各開放閱讀框所編碼的蛋白質(zhì)序列進行比對分析,預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

      1.2.4 質(zhì)粒拷貝數(shù)的測定

      1.2.4.1 糞腸球菌生長曲線的測定 挑取MRS平板上單菌落,接種于100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。每間隔2 h取1 mL培養(yǎng)液,測定培養(yǎng)液于600 nm的吸光值,測定糞腸球菌的生長曲線。

      1.2.4.2 糞腸球菌總DNA的提取 挑取MRS平板上單菌落,接種于100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至100 mL新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。8000 g離心10 min收集菌體,首先用10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA,pH8.0緩沖液洗滌菌體沉淀,參照《分子克隆實驗指南》[19]中細菌總DNA提取方法提取菌體的總DNA。

      1.2.4.3 質(zhì)??截悢?shù)的測定 采用相對定量 PCR法[20]測定內(nèi)源性質(zhì)粒在糞腸球菌EXW27中的拷貝數(shù)。選取糞腸球菌基因組上單拷貝基因gyrB作為內(nèi)參基因,內(nèi)源性質(zhì)粒上單拷貝基因repB作為目的基因。針對基因gyrB和repB分別設(shè)計熒光定量PCR引物:gyrB-F、gyrB-R、repB-F、repB-R。引物對的設(shè)計要求是引物對的擴增效率均高于95%,并且兩者的數(shù)值相差低于1%。采用所設(shè)計引物對以細菌總DNA為模板進行熒光定量PCR,并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。對糞腸球菌總DNA進行系列梯度稀釋,取已稀釋的DNA樣品作為模板,測得各樣品的CT值,將CT值與log10C0(C0為稀釋度)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所得到的引物擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率代入引物擴增效率E的計算公式(公式1)中,分別計算得到各引物對的擴增效率。取不同生長階段的糞腸球菌菌體,并按照如上方法提取總DNA,將總DNA等比稀釋至0.1~1 ng/μL,作為熒光定量PCR的模板。采用所設(shè)計引物進行熒光定量PCR,讀取熒光定量PCR反應(yīng)的CT值,并代入公式2計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

      式中,k為擴增擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

      式中,E為引物的擴增效率,△CT為用目的基因相關(guān)的引物和內(nèi)參基因相關(guān)的引物進行熒光定量PCR擴增得到的CT值的差值。

      1.2.5 質(zhì)粒最小復(fù)制子的鑒定

      1.2.5.1 大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體的構(gòu)建 通過分析質(zhì)粒的開放閱讀框,初步確定質(zhì)粒上的復(fù)制子信息。設(shè)計不同引物對(如表1所示),采用PCR技術(shù)擴增不同長度的含復(fù)制子的DNA片段。擴增F1片段所用引物對為F1-F、F1-R;擴增F2片段所用引物對為F2-F、F1-R;擴增F3片段所用引物對為F3-F、F1-R;擴增F4片段所用引物對為F2-F、F4-R;擴增F5片段所用引物對為F2-F、F5-R;擴增F6片段所用引物對為F2-F、F6-R。以大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體pXWM1的構(gòu)建為例,采用引物對F2-F、F5-R擴增F1片段,采用引物對pAM1-F、pAM1-R擴增大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體pAM1上包含紅霉素抗性基因和大腸桿菌復(fù)制子的DNA片段。將得到的兩種DNA片段均用BamHI和XhoI雙酶切處理,酶切產(chǎn)物回收后酶連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗證,獲得重組質(zhì)粒pXWM1。

      1.2.5.2 糞腸球菌感受態(tài)制備及電擊轉(zhuǎn)化 糞腸球菌感受態(tài)制備及電擊轉(zhuǎn)化參照文獻[21?23]進行。挑取 MRS 平板上單菌落,接種于100 mL新鮮的 GM17液體培養(yǎng)基 [0.5%(g/100 mL)葡萄糖、M17液體培養(yǎng)基]中,30 ℃靜置培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物以1%的接種量接種于100 mL新鮮的 SGM17 液體培養(yǎng)基 [0.5 mol/L蔗糖、0.5%(g/100 mL)葡萄糖、1%(g/100 mL)甘氨酸、M17 液體培養(yǎng)基 ]中,30 ℃靜置培養(yǎng)5~6 h。離心收集菌體沉淀,用冰浴的電擊緩沖液(0.5 mol/L蔗糖、10%甘油)洗滌兩次后,重懸于100 μL電擊緩沖液中,放置在冰上待用。向100 μL 感受態(tài)細胞中加入100 ng 重組質(zhì)粒,輕輕混勻,置于冰上備用。將含有重組質(zhì)粒的糞腸球菌感受態(tài)細胞混合液小心加入冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中,然后進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)為1.8 kV、200 Ω、25 μF,脈沖時間為4.0 ms。電擊完成后,立即向電轉(zhuǎn)杯中加入900 μL新鮮的 SGM17 液體培養(yǎng)基,30 ℃靜置復(fù)蘇2 h。取復(fù)蘇后的菌液涂布于含2.5 μg/mL 紅霉素的 MRS 固體平板,30 ℃培養(yǎng)24~48 h。

      1.2.6 穿梭載體的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性測定

      1.2.6.1 穿梭載體的宿主范圍測定 參照1.2.5.2中方法制備多種乳酸菌感受態(tài)細胞,將驗證過的能夠有效復(fù)制的穿梭載體轉(zhuǎn)化乳酸菌感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化子涂布于含2.5 μg/mL紅霉素的MRS固體平板,30 ℃培養(yǎng)48~96 h。觀察轉(zhuǎn)化平板上是否有穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌落,確定穿梭質(zhì)粒的宿主范圍。

      1.2.6.2 穿梭載體的轉(zhuǎn)化效率測定 分別取 20、50、100 和 500 ng 重組質(zhì)粒與乳酸菌感受態(tài)細胞混勻,電擊轉(zhuǎn)化乳酸菌感受態(tài)細胞,每個濃度做3個平行。轉(zhuǎn)化子于 30 ℃ 靜置活化 3 h 后,將菌懸液稀釋至合適的濃度,涂布于含 2.5 μg/mL 紅霉素的 MRS固體平板,30 ℃ 培養(yǎng) 48 h 至菌落長出。對平板菌落進行計數(shù),并計算轉(zhuǎn)化效率,最終以這四個梯度中效率最高者作為穿梭載體的轉(zhuǎn)化效率。

      1.2.6.3 穿梭載體的穩(wěn)定性測定 挑取轉(zhuǎn)化平板上單菌落接種至含25 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。再以1%接種量接種至不含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h。再次按1%接種量接種至不含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,依次傳代培養(yǎng)直至60代。稀釋培養(yǎng)好的菌液分別涂布于含紅霉素的MRS固體平板和不含紅霉素的MRS固體平板。將兩種固體平板上的菌落數(shù)代入公式3計算質(zhì)粒丟失率,并以此數(shù)據(jù)來表征質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

      1.3 數(shù)據(jù)圖像的處理

      以Primer premier 5.0的引物設(shè)計軟件進行相關(guān)引物的設(shè)計,以Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)對DNA瓊脂糖電泳凝膠進行采集及分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 質(zhì)粒的分離與序列測定

      從糞腸球菌EXW27中分離得到質(zhì)粒,并對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖1所示。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明從糞腸球菌EXW27提取得到的質(zhì)粒為單一條帶,大小約為8000 bp。將此質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pXW,并將分離純化的質(zhì)粒樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

      圖1 質(zhì)粒pXW的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of plasmid pXW

      2.2 質(zhì)粒的注釋

      將測序完成的DNA序列用SnapGene Viewer軟件進行人工拼接,繪制質(zhì)粒圖譜,如圖2A所示。質(zhì)粒pXW是雙鏈環(huán)狀DNA分子,共8617 bp,GC含量為33.29%。經(jīng)BLAST分析顯示:質(zhì)粒pXW的核苷酸序列與來源于屎腸球菌E.faeciumFS86的質(zhì)粒(GeneBank登錄號:MT501398.1)的核苷酸序列具有最高的相似性,兩者的相似率為88.37%。并且兩種質(zhì)粒的核苷酸序列比對結(jié)果顯示:除了E.faeciumFS86來源質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜(圖2B)上紅色標(biāo)記出的四個額外片段(片段 1、2、3、4)外,兩種質(zhì)粒的核苷酸序列完全一致。其中片段1在E.faeciumFS86來源質(zhì)粒上的位置為2579~2794,片段2在E.faeciumFS86來源質(zhì)粒上的位置為4477~4647,片段3在E.faeciumFS86來源質(zhì)粒上的位置為 6996~7323,片段 4在E.faeciumFS86來源質(zhì)粒上的位置為9080~9498。以上結(jié)果表明,糞腸球菌和屎腸球菌之間可能通過水平基因轉(zhuǎn)移來獲得質(zhì)粒片段或質(zhì)粒。目前,有關(guān)E.faeciumFS86來源質(zhì)粒的序列分析未見相關(guān)研究報道。本研究對自主分離得到的質(zhì)粒pXW進行序列分析。

      圖2 質(zhì)粒圖譜Fig.2 Physical map

      對質(zhì)粒pXW進行開放閱讀框(ORF)搜索,結(jié)果顯示質(zhì)粒pXW含有8個開放閱讀框。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對這些開放閱讀框進行序列信息的比對,預(yù)測所有ORF的功能,各ORF編碼的蛋白質(zhì)信息如表2所示。ORF1編碼一個含159個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),為遷移蛋白質(zhì) MobC(Mobilization protein),該MobC蛋白的氨基酸序列與來源于屎腸球菌E.faecium24-10的MobC蛋白的氨基酸序列的相似性高達99%。ORF2編碼一個含304個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),為遷移蛋白質(zhì)MobA(Mobilization protein),該MobA蛋白的氨基酸序列與來源于屎腸球菌E.faeciumAcr4的MobA蛋白的氨基酸序列的相似性高達96%。MobC蛋白和MobA蛋白可能與質(zhì)粒的遷移作用相關(guān)[24]。ORF4編碼一個含245個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),為復(fù)制起始蛋白RepB(Replication initiation protein),該RepB蛋白的氨基酸序列與來源于E.faeciumC68的RepB蛋白的氨基酸序列的相似性高達99%。RepB蛋白的BLAST分析結(jié)果顯示,RepB蛋白屬于Rep_3超家族(pfam01051),預(yù)測與質(zhì)粒的θ型復(fù)制相關(guān)[24?26]。ORF5編碼一個含178個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),為DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)(DUF536 domain-containing protein),該DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)的氨基酸序列與來源于E.faecium的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性高達99%。DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)屬于DUF536超家族,為未知功能蛋白質(zhì),預(yù)測其與質(zhì)粒的 θ型復(fù)制相關(guān)[24?26]。ORF7編碼一個含403個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),為轉(zhuǎn)座酶(transposase),該轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列與來源于E.faecium64/3 xUW2774的轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列的相似性高達100%。ORF8編碼一個含567個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),為ABC轉(zhuǎn)運器ATP-結(jié)合蛋白(ABC transporter ATP-binding protein),該 ABC轉(zhuǎn)運器 ATP-結(jié)合蛋白的氨基酸序列與來源于E.faecium的ABC轉(zhuǎn)運器ATP-結(jié)合蛋白的氨基酸序列的相似性高達99%。ORF3和ORF6在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有搜索到與其相關(guān)的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒pXW上除具有與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)(復(fù)制起始蛋白RepB和DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì))外,還包含有與質(zhì)粒遷移作用相關(guān)的蛋白質(zhì)(遷移蛋白質(zhì)MobC和MobA),以及轉(zhuǎn)座酶和ABC轉(zhuǎn)運器ATP-結(jié)合蛋白,因此質(zhì)粒pXW被歸為顯性質(zhì)粒。質(zhì)粒pXW在糞腸球菌EXW27中所起的作用有待進一步研究確證。

      表2 質(zhì)粒pXW的開放閱讀框信息Table 2 Open reading frame information for plasmid pXW

      2.3 質(zhì)??截悢?shù)的測定

      本研究采用相對定量PCR法測定內(nèi)源性質(zhì)粒pXW在糞腸球菌EXW27中的拷貝數(shù)。選取糞腸球菌基因組上單拷貝基因gyrB作為內(nèi)參基因,內(nèi)源性質(zhì)粒上單拷貝基因repB作為目的基因。針對基因gyrB和repB分別設(shè)計熒光定量PCR引物:gyrBF、gyrB-R、repB-F、repB-R。采用所設(shè)計引物以糞腸球菌EXW27總DNA為模板進行熒光定量PCR,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量PCR的產(chǎn)物,結(jié)果如圖3所示。gyrB和repB的PCR產(chǎn)物大小分別為145 bp和150 bp。對糞腸球菌EXW27的總DNA進行系列梯度稀釋,取已稀釋的DNA樣品作為模板,分別采用引物對gyrB-F/gyrB-R或repB-F/repBR進行熒光定量PCR反應(yīng),測得各樣品的CT值,將CT值與log10C0(C0為樣品的稀釋度)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示。引物對gyrB-F/gyrB-R的擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=?3.4327x+2.3219,R2=0.9995;引物對repB-F/repB-R的擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?3.4358x+5.4843,R2=0.9999。將所得的擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率代入引物擴增效率E的計算公式(公式1),計算得到引物對gyrB-F/gyrB-R和repB-F/repB-R的擴增效率分別為95.57%和95.48%。引物對的擴增效率均高于95%,而且兩者的數(shù)值相差僅為0.09%,低于1%。因此引物對gyrB-F/gyrB-R和repB-F/repB-R是可以作為相對定量PCR引物使用的。

      圖3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products

      圖4 引物擴增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of amplification efficiency of primers

      取不同生長階段的糞腸球菌EXW27菌體,并提取其總DNA,將總DNA等比稀釋至0.1~1 ng/μL,作為熒光定量PCR的模板。采用所設(shè)計引物進行熒光定量PCR,讀取熒光定量PCR反應(yīng)的CT值,并代入公式2計算在糞腸球菌EXW27于不同生長時期的質(zhì)粒pXW拷貝數(shù)。質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)隨糞腸球菌EXW27生長的變化趨勢(圖5)為:糞腸球菌EXW27的對數(shù)生長早中期時質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)最高,且基本保持穩(wěn)定,最高拷貝數(shù)為32.09±0.93;其對數(shù)生長后期至穩(wěn)定期時質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)逐漸降低,到生長穩(wěn)定期時,質(zhì)??截悢?shù)穩(wěn)定為12.75±0.79。因此糞腸球菌EXW27的內(nèi)源性質(zhì)粒pXW屬于高拷貝質(zhì)粒[27]。在細菌對數(shù)生長后期,質(zhì)??截悢?shù)發(fā)生下降屬于普遍現(xiàn)象,其中的原因可能是細菌生長后期時細胞生理代謝發(fā)生變化,細胞的生長趨于停滯,胞內(nèi)DAN合成減慢,內(nèi)源性質(zhì)粒復(fù)制所依賴的DNA聚合酶合成量也隨之下降。雖然質(zhì)粒自身編碼的復(fù)制相關(guān)蛋白可以識別復(fù)制起始位點,但是缺乏必要的酶系,導(dǎo)致復(fù)制復(fù)合體無法形成,質(zhì)粒復(fù)制受到阻礙,質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降。

      圖5 質(zhì)粒pXW的拷貝數(shù)與糞腸球菌EXW27生長曲線之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between the copy number of plasmid pXW and the growth curve of E.faecium EXW27

      2.4 質(zhì)粒的復(fù)制方式推定以及最小復(fù)制子的鑒定

      通過對質(zhì)粒pXW上的開放閱讀框進行BLAST比對分析,確定了質(zhì)粒上與其復(fù)制相關(guān)的復(fù)制蛋白,一個是復(fù)制起始蛋白RepB,一個是復(fù)制起始蛋白RepB下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)。本研究進一步對復(fù)制起始蛋白RepB的上游DNA序列進行詳細分析(如圖6所示),發(fā)現(xiàn)復(fù)制起始蛋白RepB的上游存在類似起始質(zhì)粒復(fù)制的反向重復(fù)序列和正向重復(fù)序列,推測復(fù)制起始蛋白RepB所在區(qū)域可能為復(fù)制子區(qū)域。根據(jù)以上分析,推測質(zhì)粒pXW含有1個復(fù)制子,包括復(fù)制起始子、復(fù)制起始蛋白RepB以及下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)。復(fù)制起始子含有1對13 bp的反向重復(fù)序列IR(Invert repeats,IR)、2個 8 bp的正向重復(fù)序列DR1(Direct repeats,DR)、3.5個 12 bp的正向重復(fù)序列DR2以及4.5個22 bp的正向重復(fù)序列DR3。復(fù)制起始蛋白RepB屬于Rep_3超家族(pfam01051)。Rep_3超家族中RepB蛋白均與質(zhì)粒的θ型復(fù)制相關(guān),例如糞腸球菌E.faecium226的質(zhì)粒pMBB1為θ型復(fù)制質(zhì)粒,其RepB蛋白屬于Rep_3超家族[26]。緊接其下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)為未知功能蛋白質(zhì), BLAST分析結(jié)果顯示其可能與質(zhì)粒的θ型復(fù)制相關(guān)。此外,質(zhì)粒pXW的復(fù)制子結(jié)構(gòu)屬于典型的θ型質(zhì)粒的復(fù)制子結(jié)構(gòu)[28?29]。因此推定質(zhì)粒pXW的復(fù)制類型為θ型復(fù)制。

      圖6 質(zhì)粒pXW的復(fù)制區(qū)域分析Fig.6 Genetic context of the replication region of plasmid pXW

      為了確定質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子,本研究構(gòu)建了含有不同長度復(fù)制子片段的大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體,并將不同的大腸桿菌-糞腸桿菌穿梭載體分別轉(zhuǎn)化糞腸球菌感受態(tài),驗證質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子。如圖7所示,復(fù)制子片段F1包含一部分ORF3、完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及ORF5的下游區(qū)域;復(fù)制子片段F2包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及ORF5的下游區(qū)域;復(fù)制子片段F3包含完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及ORF5的下游區(qū)域;復(fù)制子片段F4包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4、ORF5以及部分ORF5的下游區(qū)域;復(fù)制子片段F5包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4以及ORF5;復(fù)制子片段F5包含完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4以及部分ORF5。穿梭載體的轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示,含有復(fù)制子片段F1、F2、F4或F5的大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體電擊轉(zhuǎn)化糞腸球菌感受態(tài)后有菌落長出,含有復(fù)制子片段F3或F6的大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體電擊轉(zhuǎn)化糞腸球菌感受態(tài)后無菌落長出。因此,對于質(zhì)粒pXW的復(fù)制子,完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、ORF4以及ORF5是必需的。質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子包括完整的反向重復(fù)序列IR、完整的正向重復(fù)序列DR、復(fù)制起始蛋白RepB以及θ型復(fù)制相關(guān)蛋白DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白。

      圖7 質(zhì)粒pXW最小復(fù)制子的鑒定Fig.7 Minimal replicon identification of plasmid pXW

      2.5 質(zhì)粒的宿主范圍、轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性測定

      將確定最小復(fù)制子過程中構(gòu)建的含有復(fù)制片段F5的穿梭載體命名為pXWM1,其質(zhì)粒圖譜如圖8所示。為確定穿梭質(zhì)粒pXWM1的宿主范圍,將穿梭質(zhì)粒pXWM1電擊轉(zhuǎn)化至各種乳酸菌感受態(tài)細胞中,利用紅霉素標(biāo)記進行篩選,以確定穿梭質(zhì)粒pXWM1的宿主范圍,并計算其在各種乳酸菌中的轉(zhuǎn)化效率和穿梭質(zhì)粒的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,穿梭質(zhì)粒pXWM1均可在表3所示的乳酸菌中成功電轉(zhuǎn),并獲得對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子。這表明,質(zhì)粒pXW屬于寬宿主范圍質(zhì)粒。前面研究結(jié)果顯示質(zhì)粒pXW被推斷為θ型復(fù)制質(zhì)粒,質(zhì)粒較穩(wěn)定,并且質(zhì)粒pXW含有質(zhì)粒遷移蛋白MobC和MobA,這些因素與該質(zhì)粒屬于寬宿主質(zhì)粒是相符合的。

      圖8 pXWM1的質(zhì)粒圖譜Fig.8 Physical map of pXWM1

      穿梭質(zhì)粒pXWM1在表3所示的乳酸菌中的電擊轉(zhuǎn)化效率介于 1.96×102~8.96×104CFU/μg (質(zhì)粒DNA)之間,比普通乳酸菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率(10~105CFU/μg質(zhì)粒DNA)略低。穿梭質(zhì)粒比普通乳酸菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率略低的可能原因是[30]:乳酸菌宿主菌中存在限制性修飾系統(tǒng),排斥未甲基化的外源質(zhì)粒;乳酸菌宿主菌內(nèi)可能存在不親和群的質(zhì)粒;不同乳酸菌宿主菌的DNA甲基化水平;以及其他限制轉(zhuǎn)化效率的因素如電擊電壓、電擊緩沖液、感受態(tài)細胞的狀態(tài)等。穿梭載體pXWM1在表3所示的乳酸菌中經(jīng)過60代連續(xù)傳代培養(yǎng)后,穿梭質(zhì)粒的丟失率介于28.54%~54.17%之間。穿梭載體pXWM1在不同乳酸菌感受態(tài)細胞中電轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒穩(wěn)定性的差異,可能與質(zhì)粒和宿主菌的相容性相關(guān)[14]。

      表3 穿梭載體pXWM1在不同乳酸菌宿主中的轉(zhuǎn)化效率和穩(wěn)定性Table 3 Transformation efficiency and stability of shuttle vector plasmid pXWM1 in different hosts

      3 結(jié)論

      從具有優(yōu)良益生特性的糞腸球菌E.faecalisEXW27中分離得到了內(nèi)源性質(zhì)粒pXW,該質(zhì)粒大小為8617 bp,GC含量為33.29%。針對該質(zhì)粒DNA序列的BLAST分析結(jié)果顯示質(zhì)粒pXW為新質(zhì)粒。進一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該質(zhì)粒編碼8個ORF,其中包括質(zhì)粒遷移作用蛋白MobC(ORF1)和 MobA(ORF2)、質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白 RepB(ORF4)、θ型復(fù)制相關(guān)蛋白DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白(ORF5)、轉(zhuǎn)座酶(ORF7)、ABC 轉(zhuǎn)運器 ATP-結(jié)合蛋白(ORF8)以及假定蛋白質(zhì)(ORF3、ORF6)。根據(jù)復(fù)制起始蛋白RepB、緊接其下游的DUF536結(jié)構(gòu)域包含蛋白以及復(fù)制子的序列分析,推測該質(zhì)粒的復(fù)制方式為θ型復(fù)制。質(zhì)粒pXW在糞腸球菌EXW27中拷貝數(shù)最高可達32.09±0.93,表明質(zhì)粒pXW屬于高拷貝數(shù)質(zhì)粒。本研究確定了質(zhì)粒pXW的最小復(fù)制子,并利用該復(fù)制子成功構(gòu)建大腸桿菌-糞腸球菌穿梭載體pXWM1。該穿梭載體的宿主范圍寬,實現(xiàn)了在多種乳酸菌中的成功轉(zhuǎn)化,并且轉(zhuǎn)化效率高,質(zhì)粒丟失率低。質(zhì)粒pXW的這些優(yōu)良特性有利于將其改造為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乳酸菌工程載體。

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