纖維軟骨透明化的研究進(jìn)展

史冬泉 李嘉威

軟骨是人體中必不可少的組織，分布在人體的四肢關(guān)節(jié)，椎間盤，支氣管和外耳輪廓等。四肢關(guān)節(jié)處的軟骨組織為透明軟骨，主要起著承重和抗磨損的作用。膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)等承重關(guān)節(jié)的透明軟骨在骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)中產(chǎn)生磨損和退變是其主要致病因素之一。軟骨組織中因為缺乏血管，神經(jīng)和淋巴組織，其自身修復(fù)能力十分有限。一項針對OA軟骨細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在OA進(jìn)展的晚期階段，關(guān)節(jié)中的透明軟骨在經(jīng)歷炎癥和磨損后逐漸被纖維軟骨所取代[1]。傳統(tǒng)的軟骨修復(fù)技術(shù)，包括自體軟骨細(xì)胞植入和微骨折無法復(fù)制出天然軟骨組織的生物力學(xué)特性[2]。有研究報道在自體軟骨細(xì)胞植入后，關(guān)節(jié)中的生物力學(xué)環(huán)境和化學(xué)環(huán)境會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞表型，導(dǎo)致90%以上的新生修復(fù)組織為纖維軟骨[3]。正常的軟骨能夠承受的力高達(dá)體重的6倍[4]。承重時，透明軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)部的靜電和空間相互作用阻止了水分流失并承擔(dān)了大部分負(fù)載。但是，纖維軟骨無法實現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系[5]。所以纖維軟骨在承重和抗機(jī)械磨損方面的能力遠(yuǎn)不如透明軟骨，關(guān)節(jié)中纖維軟骨會導(dǎo)致OA病情的進(jìn)一步惡化[6]。近年來發(fā)展迅速的軟骨組織工程雖然為透明軟骨的生成提供了很多的選擇[7]，但纖維軟骨始終被作為摒棄的對象，沒有加以利用和開發(fā)。因此，OA和軟骨損傷后所產(chǎn)生的纖維軟骨是不可忽視的存在且必須考慮軟骨損傷修復(fù)治療原則中。阻止透明軟骨纖維化和促進(jìn)纖維軟骨透明化有效利用原位纖維軟骨改性，將作為研究開發(fā)的重點。本文將從纖維軟骨產(chǎn)生的病理機(jī)制出發(fā)，討論透明軟骨和纖維軟骨的差別，并進(jìn)一步探索針對纖維軟骨的治療策略，提出"纖維軟骨透明化"的治療原則，展望纖維軟骨透明化的可行性。纖維軟骨透明化的關(guān)鍵是利用病變或周圍區(qū)域的細(xì)胞外基質(zhì)(包括膠原蛋白和糖蛋白)，以及動員或修飾鄰近的組織和細(xì)胞(纖維軟骨細(xì)胞和透明軟骨細(xì)胞)以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。

一、關(guān)節(jié)軟骨纖維化是纖維軟骨產(chǎn)生的主要原因

組織損傷的修復(fù)過程包括細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和重塑。但是異常的修復(fù)過程會導(dǎo)致組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度分泌和沉積，繼而引起過度的纖維化，最終導(dǎo)致瘢痕形成甚至組織破壞[8]。雖然在其他類型的軟骨組織(如半月板或椎間盤)中可以發(fā)現(xiàn)纖維軟骨的存在，但在關(guān)節(jié)軟骨中它的出現(xiàn)卻提示著軟骨組織的退變損傷。OA過程或軟骨損傷修復(fù)中形成的纖維軟骨就是關(guān)節(jié)軟骨過度纖維化的結(jié)果。在病理條件下，軟骨細(xì)胞的合成分解代謝的紊亂會導(dǎo)致軟骨損傷和退變。因此原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的透明軟骨細(xì)胞開始活躍增生，并在軟骨病變區(qū)域中形成細(xì)胞簇，以適應(yīng)軟骨微環(huán)境的變化[9]?；钴S增殖的軟骨細(xì)胞開始轉(zhuǎn)變或去分化為具備成纖維細(xì)胞表型的細(xì)胞。其細(xì)胞形狀，代謝方式和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生急劇變化，最終導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)合成的增加，該膠原蛋白通過形成無機(jī)械能力的纖維軟骨樣組織而削弱了軟骨組織的生物功能[10]。在正常的關(guān)節(jié)透明軟骨中，Ⅰ型膠原蛋白僅占總體積的1.7%，而Ⅱ型膠原蛋白占近100%。Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)表達(dá)的減少和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的增加是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞去分化和纖維化的主要特征。軟骨細(xì)胞和周圍環(huán)境的這些變化最終導(dǎo)致異常的軟骨細(xì)胞增殖和肥大分化，最終引起軟骨細(xì)胞凋亡。

二、透明軟骨與纖維軟骨

透明軟骨是最常見的軟骨類型，在發(fā)育過程中可作為胚胎的臨時骨架直到逐漸被骨組織替代為止。透明軟骨的基質(zhì)由豐富的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)和高度黏附的膠原纖維組成[11]，其軟骨細(xì)胞的形態(tài)主要為圓形。透明軟骨的主要膠原蛋白類型是Ⅱ型膠原蛋白(> 90%)，但是Ⅲ型膠原蛋白(0～10%)，Ⅸ型膠原蛋白(1%)，Ⅺ型膠原蛋白(3%)，Ⅵ型膠原蛋白在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要固體成分，可通過限制帶負(fù)電荷的GAGs施加的溶脹壓力來提供組織的整體形狀。在OA或軟骨損傷過程中，形成的最常見的非透明軟骨組織是機(jī)械性較差、富含Ⅰ/ Ⅱ型膠原蛋白的纖維軟骨。但是目前對于纖維軟骨仍然缺乏一個精準(zhǔn)的定義，因此纖維軟骨組織學(xué)和免疫組織化學(xué)特征成為鑒定的基礎(chǔ)。有研究報道，纖維軟骨是一種介于透明軟骨與密集規(guī)則的結(jié)締組織(如肌腱和韌帶)之間的過渡組織[12]。Ⅰ型膠原蛋白的增加使得軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)的排列變得更加致密，軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)如成纖維細(xì)胞樣的梭形狀態(tài)，因此無法實現(xiàn)透明軟骨原有的承重和抗磨損的生物功能。相對于透明軟骨細(xì)胞，纖維軟骨細(xì)胞最重要的特征就是產(chǎn)生成纖維細(xì)胞的表型，比如包含α-SMA(α-smooth muscle actin),一種纖維細(xì)胞所含有的細(xì)胞骨架蛋白。因此纖維軟骨細(xì)胞表型的特征可以概括為以下幾點:(1)同時表達(dá)軟骨細(xì)胞表型蛋白(SOX9,Col Ⅱ)和纖維細(xì)胞表型蛋白(α-SMA,Col Ⅰ);(2) Ⅱ型膠原和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)或者mRNA表達(dá)水平的比例約為0.2～1[12];(3) 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal stem cells,MSCs)和造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物(CD106,CD146,ITGA11,CD34,CD45,CD133) 處于低表達(dá)水平[1]。

纖維軟骨的形成以及透明軟骨細(xì)胞的纖維化涉及到許多復(fù)雜的生物過程和信號通路。其中最為關(guān)鍵的兩個細(xì)胞因子是轉(zhuǎn)化組織生長因子-β(transform growth factor-β，TGFβ)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)。TGFβ-SMAD2/3信號通路在透明軟骨形成的生物過程中扮演重要角色，能夠促進(jìn)SOX9轉(zhuǎn)錄因子和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)成軟骨分化和維持軟骨表型。但是CTGF的表達(dá)同樣也受TGFβ表達(dá)介導(dǎo)，其能夠促進(jìn)Ⅰ型膠原表達(dá)并在組織纖維化的過程中起關(guān)鍵作用。同時過度表達(dá)的TGFβ將會激活SMAD1/5/8通路以加強(qiáng)軟骨肥大化過程。因此，功能紊亂的TGFβ信號通路和CTGF誘導(dǎo)的纖維化作用是軟骨細(xì)胞表型發(fā)生改變的關(guān)鍵因素。同樣，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的幾種成分也會影響軟骨細(xì)胞的表型和行為，例如富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucin-rich proteoglycans,SLRPs)[13]，腱生蛋白C(tenascin-C)[14]，層黏連蛋白(Laminin)和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)[15]。此外，細(xì)胞外基質(zhì)或關(guān)節(jié)軟骨的微環(huán)境也會影響損傷或退變期間的軟骨細(xì)胞，包括炎癥因子水平，基質(zhì)降解酶的活性和組織中的氧含量。對于軟骨細(xì)胞纖維化過程的認(rèn)識以及透明軟骨和纖維軟骨區(qū)別的理解是開展纖維軟骨透明化策略最重要的基礎(chǔ)。

三、纖維軟骨透明化的展望

近年來對于軟骨組織和細(xì)胞的生理病理學(xué)的深入理解推動了軟骨損傷修復(fù)中透明軟骨形成的研究。然而，纖維軟骨是在OA和軟骨損傷中不可避免形成的副產(chǎn)物?？紤]到纖維軟骨是導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能進(jìn)一步惡化的主要因素之一，因此本文認(rèn)為將纖維軟骨原位改造或修飾為透明軟骨，即“纖維軟骨透明化”作為軟骨損傷修復(fù)治療的重要原則之一是十分必要的。損傷或病變區(qū)域軟骨的細(xì)胞外環(huán)境的改性或修飾以及纖維軟骨細(xì)胞自身轉(zhuǎn)化，是纖維軟骨原位改造的兩個重要出發(fā)點。此外，加強(qiáng)透明軟骨表型和抑制纖維化作用是擬開展纖維軟骨透明化的兩個重要方向。

四、原位纖維軟骨細(xì)胞改性促進(jìn)纖維軟骨透明化

軟骨組織是人體重要的承重組織，因此軟骨細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架在感知細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械信號以及轉(zhuǎn)為生物信號的過程中扮演重要角色。細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)是一種高度組織化的結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)許多不同的細(xì)胞生物過程，包括改變細(xì)胞形狀，細(xì)胞器運(yùn)動，細(xì)胞遷移，內(nèi)吞作用，分泌，細(xì)胞分裂和細(xì)胞外基質(zhì)形成。有研究報道，細(xì)胞骨架的分布和排列以及細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性來影響軟骨細(xì)胞的代謝和分化[16]。細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D) 能夠通過抑制軟骨細(xì)胞微絲蛋白(actin)的聚合來促進(jìn)軟骨相關(guān)蛋白的表達(dá)來維持軟骨功能[17]。此外，維持中間絲蛋白(vimentin intermediate filament)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性有利于軟骨表型的維持，其結(jié)構(gòu)的紊亂或破壞會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變，OA病情的進(jìn)展以及關(guān)節(jié)功能的惡化[18]。細(xì)胞骨架重塑會影響軟骨細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和分泌，進(jìn)而決定細(xì)胞的行為和功能，再而確定軟骨細(xì)胞分化的方向。盡管細(xì)胞骨架重塑具有一定成軟骨作用，但是是否可以從細(xì)胞自身內(nèi)部轉(zhuǎn)化的角度將退變的纖維軟骨細(xì)胞恢復(fù)為透明軟骨細(xì)胞仍需進(jìn)一步研究。

各類生長因子，包括CTGF、TGFβ和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors,FGFs)和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在由于其強(qiáng)大的增殖潛力以及在合成分解代謝上的影響能力，在軟骨修復(fù)中得到廣泛研究。CTGF是CCN家族的重要成員。有研究報道，使用CTGF和TGFβ同時誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞可使其分化為α-SMA陽性的纖維細(xì)胞以用于結(jié)締組織的修復(fù)[19]。在FGF家族中，F(xiàn)GF18與軟骨細(xì)胞的FGFR3特異性相互作用，參與軟骨生成和骨骼發(fā)育，改善健康軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[20]。IGF-1是軟骨的主要合成代謝因子，并且在軟骨穩(wěn)態(tài)維持，平衡蛋白聚糖合成和軟骨細(xì)胞分解中起關(guān)鍵作用[21]。因此，在纖維軟骨細(xì)胞中通過生物學(xué)手段調(diào)控各類生長因子的水平和活性來進(jìn)行纖維軟骨透明化具有一定可行性。

五、原位纖維軟骨細(xì)胞外環(huán)境修飾促進(jìn)纖維軟骨透明化

細(xì)胞外環(huán)境的組成環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外氧含量，細(xì)胞外離子水平(滲透壓)以及炎癥因子和基質(zhì)降解酶等。這些因素都能夠成為促進(jìn)纖維軟骨透明化策略的研究對象。膠原蛋白是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)最主要的成分，并在維持軟骨組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)以及生物功能中起重要作用。Ⅱ型膠原蛋白的含量決定了透明軟骨的質(zhì)量和組織的功能。據(jù)報道，除了構(gòu)成組織的結(jié)構(gòu)外，額外的Ⅱ型膠原蛋白補(bǔ)充還可以通過增加GAG和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)而加強(qiáng)軟骨細(xì)胞的成軟骨能力[22]。外源補(bǔ)充Ⅱ型膠原蛋白具有兩個優(yōu)勢，即通過填充原始的細(xì)胞外基質(zhì)來改善局部軟骨組織的Ⅱ/Ⅰ型膠原的比例以及增強(qiáng)原位纖維化組織中細(xì)胞的成軟骨能力。另外，在OA發(fā)展或軟骨損傷期間，軟骨下骨內(nèi)的細(xì)胞血管生成因子表達(dá)升高，包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血小板來源的生長因子B(platelet-derived growth factor subunit B，PDGFB)，以增加軟骨下骨內(nèi)的血管密度。此外，病理原因?qū)е碌男律苄纬蓪?dǎo)致軟骨內(nèi)氧含量水平上調(diào)，從而破壞了軟骨區(qū)域內(nèi)原本低氧性環(huán)境。有研究驗證缺氧作用能夠增強(qiáng)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)的表達(dá)并降低I型和X型膠原的水平[23]。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors,HIF)是一類重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧的病理生理反應(yīng)。由于軟骨細(xì)胞在生理條件下適應(yīng)低氧環(huán)境，因此軟骨細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)活躍可能是對軟骨缺氧低氧環(huán)境中生存的主要適應(yīng)方法。此外，HIF-1α在早期骨骼生成過程中缺氧環(huán)境中能夠顯著促進(jìn)軟骨前細(xì)胞中SOX9的表達(dá)和軟骨形成[24]。因此，缺氧或HIF-1α在纖維軟骨細(xì)胞中的作用以及針對纖維軟骨透明化的可行性有待進(jìn)一步研究。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的滲透壓大約為350～450 mOsm，主要由局部的多糖濃度和離子水平?jīng)Q定。細(xì)胞外基質(zhì)中GAG的側(cè)鏈富含負(fù)電荷，因此會吸引關(guān)節(jié)液中大量陽離子，包括Na+，K+,Ca2+等。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)特殊的離子環(huán)境為其提供了一個高滲環(huán)境。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或OA發(fā)生時，關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滑液的滲透壓會下降四分之一左右，從而進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)內(nèi)組織的細(xì)胞生物表型的改變。我們有理由相信，關(guān)節(jié)內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)將會是在纖維軟骨透明化策略中可行且有效的手段。

六、軟骨組織工程在纖維軟骨透明化中的作用

軟骨組織工程是運(yùn)用于軟骨修復(fù)的一項結(jié)合生物學(xué)和工程學(xué)等多學(xué)科的策略。軟骨組織工程在OA治療以及軟骨修復(fù)的基礎(chǔ)實驗研究和動物實驗中取得巨大進(jìn)展?？勺⑸湫退z(hydrogel)不僅可以提供類似于透明軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性以及高度水合的3D結(jié)構(gòu)，并且還能夠通過其本身的黏彈性特性來改善營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的輸出，甚至可以包載具有干性的細(xì)胞來更有效地進(jìn)行細(xì)胞移植和傳遞生物活性分子[25]?？勺⑸湫退z為軟骨再生提供了有希望的方向，但是在考慮纖維軟骨透明化時，生物材料的設(shè)計要結(jié)合纖維軟骨原位改造的原則并且需要探索更多手段以保證更加有效地實施。

七、總結(jié)

纖維軟骨透明化是符合臨床實際情況和軟骨病理生理情況的軟骨修復(fù)策略。然而，纖維軟骨透明化的研究還面臨著一些挑戰(zhàn)。首先，很難獲得用于體外實驗的表型穩(wěn)定的纖維軟骨細(xì)胞。其次，將在組織上已經(jīng)形成的纖維軟骨逆轉(zhuǎn)為透明軟骨并恢復(fù)為原始的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)是相當(dāng)困難的。第三，需要更加合理且智能的生物材料來輔助完成纖維軟骨透明化策略。為了避免對健康組織的影響，能夠智能且特異地靶向治療纖維軟骨的生物材料是必不可少的。此外，藥物和生物活性因子如何向致密纖維基質(zhì)里滲透也是研究方向之一。纖維軟骨透明化是一個新的概念和研究方向，目前還沒有證據(jù)明確的研究結(jié)果以及邏輯清晰的研究方案，所以這需要眾多軟骨修復(fù)研究者共同努力去解決這一令人困擾的問題。我們相信纖維軟骨透明化是軟骨修復(fù)的最有希望和潛力的治療原則和策略。