劉俊 趙鑫 陳貝 石新 李煕瑩 曹焱鵬 陳耀武 呂紅斌

骨腱界面(bone-tendon interface,BTI)是存在于肌腱和骨之間的錨定結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成結(jié)構(gòu)的不同可分為纖維性BTI和纖維軟骨性BTI。纖維軟骨性骨腱界面包括肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨及骨這四層相互延續(xù)的結(jié)構(gòu)。骨腱界面的組織成分、細(xì)胞排列和力學(xué)性能具有梯度漸變的特點(diǎn)，有利于應(yīng)力在軟硬界面(肌腱和骨)之間的傳導(dǎo)[1]。相對(duì)于骨和肌腱的愈合，骨腱界面的損傷修復(fù)更加緩慢，組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)骨腱損傷處的基質(zhì)成分和組織結(jié)構(gòu)紊亂，且常伴有瘢痕組織增生[2]。損傷的骨腱界面無法快速完全地恢復(fù)至損傷前的正常層次結(jié)構(gòu)，其生物力學(xué)性能較差，這將直接影響病人運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[1]。因此，如何促進(jìn)骨腱界面損傷后快速而優(yōu)質(zhì)的愈合及其功能的恢復(fù)是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的難題。

一、骨腱界面組織結(jié)構(gòu)和成分的梯度漸變特征

骨腱界面的功能取決于其結(jié)構(gòu)的完整性，大量的研究從宏觀和微觀角度對(duì)骨腱界面的力學(xué)環(huán)境進(jìn)行了解析：肌腱纖維、細(xì)胞排列、礦化分布、基質(zhì)成分等骨腱界面組織在應(yīng)力傳導(dǎo)方向上呈現(xiàn)出梯度演變的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這一結(jié)構(gòu)特征有利于提高應(yīng)力在軟、硬界面中的傳導(dǎo)效率[1,3]。利用同步輻射技術(shù)對(duì)骨腱界面的化學(xué)成分進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，在骨腱界面纖維軟骨層中富含蛋白多糖以及鈣、鋅等微量元素，這些基質(zhì)成分的含量及分布也同樣呈現(xiàn)出梯度漸變的特點(diǎn)[4]。

有研究證實(shí)，損傷狀態(tài)下梯度漸變的組織結(jié)構(gòu)的破壞是骨腱界面損傷的主要組織病理特征。在骨腱界面損傷修復(fù)的過程中，瘢痕組織占據(jù)了大量的組織再生空間，原來的四層結(jié)構(gòu)難以有序恢復(fù)至損傷前水平[2]。另外，損傷后的骨腱界面中各種膠原、蛋白成分及金屬元素都有不同程度的丟失，并且在損傷區(qū)域內(nèi)排列紊亂、極性缺失，應(yīng)力的傳導(dǎo)方向也各不相同[2,5]。

二、實(shí)現(xiàn)骨腱界面損傷有序再生的新要求

骨腱界面的組織結(jié)構(gòu)包括力學(xué)性能完全不同的生物組織：肌腱、軟骨和骨，當(dāng)外界應(yīng)力施加于以上具有不同力學(xué)性能的組織時(shí)，它們將出現(xiàn)不均勻的形變，這會(huì)引起界面處的應(yīng)力集中，進(jìn)而增加骨腱連接部位撕裂或術(shù)后再撕裂的風(fēng)險(xiǎn)[1]。實(shí)現(xiàn)骨腱界面有序再生的重點(diǎn)即在于促進(jìn)骨腱界面中骨、軟骨、肌腱的再生，在2017年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院舉辦的肌腱韌帶專題會(huì)議上，領(lǐng)域權(quán)威著重討論了骨腱界面損傷修復(fù)的新策略，明確指出實(shí)現(xiàn)骨腱界面損傷后的原位修復(fù)極具挑戰(zhàn)，促進(jìn)骨腱界面損傷區(qū)域的骨、軟骨、肌腱的有序再生是治療骨腱相關(guān)疾病的重要出路[5]。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，激發(fā)損傷區(qū)骨、軟骨、肌腱的修復(fù)潛能，恢復(fù)損傷區(qū)域骨腱界面原有的組織結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成分的梯度漸變特征，是重建骨腱功能的最理想方案[6]。

三、組織工程技術(shù)促進(jìn)骨腱界面有序再生的應(yīng)用策略

組織工程技術(shù)在骨腱界面的研究中的應(yīng)用前景廣闊。鑒于恢復(fù)梯度漸變的組織結(jié)構(gòu)是促進(jìn)骨腱界面有序再生的重要目標(biāo)，目前的組織工程實(shí)踐側(cè)重于模擬天然骨腱界面的微觀結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜的細(xì)胞及其生存微環(huán)境[7]。我們可以針對(duì)材料進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)和修飾，來部分實(shí)現(xiàn)正常骨腱界面梯度結(jié)構(gòu)的仿生。此外，再生微環(huán)境中內(nèi)源性干細(xì)胞方面的最新研究進(jìn)展也給我們?cè)O(shè)計(jì)骨腱界面損傷后組織的原位有序再生策略提供了新的種子細(xì)胞來源[5]。

為了實(shí)現(xiàn)骨腱界面中骨、軟骨和肌腱的有序再生的目標(biāo)，我們應(yīng)該更加地關(guān)注支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子三者的協(xié)同作用，其遠(yuǎn)期的應(yīng)用發(fā)展主要集中于：材料的仿生設(shè)計(jì)、種子細(xì)胞優(yōu)化和生長(zhǎng)因子控釋這三個(gè)方向[7]。

1.支架材料的仿生設(shè)計(jì):支架的構(gòu)建一直是廣大學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)。一方面，我們需要材料來模擬正常骨腱界面的結(jié)構(gòu)特征，實(shí)現(xiàn)形態(tài)和力學(xué)性能的梯度漸變仿生。另一方面，支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性，尤其應(yīng)該具備優(yōu)越的性能-細(xì)胞交互性，能夠促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)細(xì)胞定向分化并分泌特定的細(xì)胞外基質(zhì)，從而形成梯度漸變的組織結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)骨腱界面的原位再生[6]。

利用去細(xì)胞技術(shù)制備的生物衍生支架材料具有組織天然相容、結(jié)構(gòu)自然仿生的優(yōu)勢(shì)。這類材料由于去除了組織內(nèi)的細(xì)胞和抗原物質(zhì)，因此避免了免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，這類材料往往保留了與正常組織相似的組織成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)，能夠最大限度地保留原組織的力學(xué)性能[8]。在組織工程去細(xì)胞支架的研究中，學(xué)者們遇到諸多問題，他們往往在減少試劑殘留、基質(zhì)成分保留和提高脫細(xì)胞效率等問題之間難以取舍。學(xué)者們采用物理方法對(duì)組織塊進(jìn)行切割、打孔，試圖在利于細(xì)胞遷入、保留力學(xué)性能和提高去細(xì)胞效率之間找到平衡點(diǎn)[8-9]。一方面，類似“書頁”狀組織薄片切割通過增加去細(xì)胞液與組織的接觸面積，能夠顯著縮短組織去細(xì)胞的處理時(shí)間，避免細(xì)胞外基質(zhì)成份的大量流失，并且能夠最大限度地保留原組織的力學(xué)性能。另一方面，薄片支架之間的固有物理間隙給干細(xì)胞的遷入提供了空間，這無疑有利于支架的再生命化和組織原位修復(fù)再生[10-11]。

針對(duì)單純?nèi)ゼ?xì)胞支架中細(xì)胞成分丟失、難以再生命化的難點(diǎn)，采用去細(xì)胞支架材料負(fù)載具有修復(fù)效應(yīng)的干細(xì)胞往往能夠重新賦予組織工程支架生物活性[12]。學(xué)者們通過制備一種形態(tài)結(jié)構(gòu)仿生、成軟骨誘導(dǎo)性能優(yōu)良的去細(xì)胞纖維軟骨書頁支架，并與宿主的自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞片合體組裝，最終制備成具有自主生命力的組織工程纖維軟骨移植物，該移植物能夠顯著促進(jìn)纖維軟骨再生[13]。為了提高去細(xì)胞生物支架的仿生性能，學(xué)者們將獲取的骨、纖維軟骨和肌腱組織分別制成易于吸收的薄片書頁狀支架后，進(jìn)行去細(xì)胞處理，并根據(jù)天然骨腱界面梯度漸變的結(jié)構(gòu)和成分特征，將去細(xì)胞骨、軟骨、肌腱這3種支架進(jìn)行堆疊組裝，從而構(gòu)建結(jié)構(gòu)與成分仿生的去細(xì)胞三相書頁支架[14]。相比于單一組織來源的支架骨腱界面移植物，三相支架能夠更好地模擬骨腱界面的梯度漸變特性。

在人工材料領(lǐng)域，學(xué)者們利用高分子材料作為首選的支架材料。目前多采用磷酸三鈣、羥基磷灰石和生物活性玻璃等材料。這些材料在體內(nèi)降解緩慢、重復(fù)性好，具有易于調(diào)節(jié)、易于修飾的特點(diǎn)。能夠精確地控制材料的硬度、制備工藝及表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等特性，這使設(shè)計(jì)的支架能夠較好地模擬出正常骨腱界面的形態(tài)特征[7]。隨著一些具有良好的生物相容性和親和性的材料的出現(xiàn)，新近設(shè)計(jì)的組織工程支架更易于局部細(xì)胞的附著，并且能夠創(chuàng)造一個(gè)適合細(xì)胞增殖和分化的環(huán)境[7,15]。已有學(xué)者利用生物相容性較好的多聚物，制備了力學(xué)仿生的組織工程支架和補(bǔ)片以促進(jìn)肌腱以及纖維軟骨層的再生，從而治療骨腱損傷性疾病[7]。針對(duì)單一材料的組織工程移植物難以在一個(gè)支架上實(shí)現(xiàn)差異化設(shè)計(jì)及仿生骨腱界面梯度結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的難題，分層仿生設(shè)計(jì)的高分子材料支架應(yīng)運(yùn)而生[15]。這種組織工程支架旨在模擬正常骨腱界面的漸變結(jié)構(gòu)，從而重建骨腱界面的生物學(xué)功能。通過在體外制備了異質(zhì)性的多層結(jié)構(gòu)支架，來模擬天然骨腱界面結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，且在不同區(qū)域誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨、成肌腱分子特異性表達(dá)，旨在促進(jìn)骨腱界面中骨、軟骨和肌腱的有序愈合。

2.種子細(xì)胞優(yōu)化:具有修復(fù)能力的細(xì)胞在界面組織中的再生、組成和穩(wěn)態(tài)中起著“原動(dòng)力”的作用。一般來說，種子細(xì)胞可以分為兩種不同類型的細(xì)胞：功能細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞；未分化細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和組織特異性干細(xì)胞[7]。

功能細(xì)胞是不具備增殖能力的成熟體細(xì)胞，常選擇目標(biāo)組織中的主要細(xì)胞成分來用作種子細(xì)胞。應(yīng)用功能細(xì)胞能夠直接補(bǔ)充損傷區(qū)域丟失的組織細(xì)胞或者替代損傷后功能失調(diào)的殘留細(xì)胞。相較于難以確定最終分化方向的干細(xì)胞，功能細(xì)胞的生命路線通常更加確切可控。目前，已有大量研究采用軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞等應(yīng)用于諸如軟骨缺損、肌腱損傷等運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷的治療[16]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程未分化細(xì)胞的理想選擇。它們來源于發(fā)育早期的中胚層，在成年個(gè)體的骨髓、脂肪等組織中保持靜息狀態(tài)，其增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、多向分化潛能好，可在體內(nèi)分化成包括骨、軟骨、肌肉、韌帶等多種類型的組織[6,17]。學(xué)者最早將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植在腘繩肌腱移植物的表面，結(jié)果顯示復(fù)合干細(xì)胞的移植物能夠更快地與骨隧道愈合，在術(shù)后2周就形成非常明顯的纖維軟骨層[18]。其他諸如脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、尿源性干細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)具有自我更新與多方向分化潛能，同時(shí)具備數(shù)量多、易于獲取的特點(diǎn)，已有研究證實(shí)它們?cè)诠请旖缑鎿p傷修復(fù)中起到積極的作用[16]。

也有學(xué)者嘗試在肌腱組織中尋找具有增殖分化能力的內(nèi)源性干細(xì)胞，并用來治療肌腱損傷?，F(xiàn)有的觀點(diǎn)認(rèn)為骨、肌腱組織特異分布的干細(xì)胞能夠更好地適應(yīng)組織原位的微環(huán)境，在植入后能夠保持較高的活性[17]。學(xué)者們收集前交叉韌帶來源的CD34陽性細(xì)胞，制備成富含種子細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)的干細(xì)胞片，將干細(xì)胞片包裹在肌腱移植物的表面并植入前交叉韌帶重建的骨隧道內(nèi)來促進(jìn)骨腱界面的愈合[18]。

為了規(guī)避術(shù)后炎癥反應(yīng)對(duì)外源性干細(xì)胞的損耗，學(xué)者們選擇在宿主的炎癥反應(yīng)消退后，將干細(xì)胞注射到骨腱所在的關(guān)節(jié)內(nèi)，通過緩釋具有趨化作用的生長(zhǎng)因子來募集外源性干細(xì)胞到達(dá)骨腱界面的損傷局部，并參與其修復(fù)過程。此方案簡(jiǎn)化了支架在體外負(fù)載細(xì)胞的步驟，一定程度上保障了植入細(xì)胞的存活率，并且有效地規(guī)避了術(shù)后早期炎性反應(yīng)對(duì)外源性干細(xì)胞的損耗，這為開發(fā)骨腱界面組織工程治療方案提供了一種新模式，有利于進(jìn)一步在臨床推廣應(yīng)用[19]。

3.細(xì)胞因子控釋:探索不同生長(zhǎng)因子組合和輸送模式對(duì)骨腱愈合的影響是界面組織工程在未來幾年將面臨的挑戰(zhàn)之一。研究表明，生長(zhǎng)因子在骨腱界面的組織發(fā)育、穩(wěn)態(tài)保持和損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，根據(jù)生理效應(yīng)的不同主要分為分化誘導(dǎo)因子、血管生成因子、趨化因子等。不同的細(xì)胞因子對(duì)骨、軟骨、肌腱等多相組織的修復(fù)發(fā)揮著迥然不同的作用。研究表明，2型骨形成蛋白(BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)等能夠分別通過誘導(dǎo)組織成骨、成軟骨分化，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能夠誘導(dǎo)血管形成，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)能夠募集干細(xì)胞至損傷區(qū)域[7,20]。骨腱界面結(jié)構(gòu)的梯度漸變特征給細(xì)胞因子在局部的應(yīng)用提出了更高的要求，要恢復(fù)損傷后骨腱界面的功能，就需要再生組織中的骨、軟骨、肌腱細(xì)胞，并合成、重塑相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)[6,20]。鑒于此，在骨腱界面中采用細(xì)胞因子策略需要重點(diǎn)關(guān)注成骨分化、成軟骨和成肌腱分化誘導(dǎo)因子的應(yīng)用。

另外，嚴(yán)格控制生長(zhǎng)因子的作用位置和濃度對(duì)于刺激特定細(xì)胞分化的行為至關(guān)重要。某些生物因子與支架負(fù)載不強(qiáng)，在植入體內(nèi)后會(huì)以瀑布式釋放的模式大量分布在移植物周圍，局部高濃度的生物因子有引起細(xì)胞凋亡、異常分化的風(fēng)險(xiǎn)[7]。而當(dāng)大量早期釋放的生物因子被滅活后，后續(xù)從支架中釋放的殘留細(xì)胞因子不足以發(fā)揮足夠的生物效應(yīng)。為了規(guī)避上述生物因子應(yīng)用的不足，學(xué)者們通過修飾支架材料、修飾生物因子、制備緩釋微球等方式來實(shí)現(xiàn)生物因子在材料上的附著和緩慢釋放[20]。

為了提高細(xì)胞因子在支架材料上的緩釋效果，學(xué)者們另辟蹊徑，他們合成并純化了具有膠原結(jié)合特性的基質(zhì)衍生蛋白1α(C-SDF-1α)，并證實(shí)具有膠原結(jié)合特性的SDF-1α有著與正常SDF-1α(N-SDF-1α)相當(dāng)?shù)母杉?xì)胞募集效能，C-SDF-1α可特異性地結(jié)合在去細(xì)胞纖維軟骨書頁支架上的膠原成分，從而實(shí)現(xiàn)生物因子在支架上的緩慢釋放。

四、展望

隨著材料科學(xué)和醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，組織工程的理論和技術(shù)在骨腱界面中的應(yīng)用已達(dá)到前所未有的高度。學(xué)者們?cè)谔綄ば虏牧?、新工藝的同時(shí)，更加關(guān)注材料和移植微環(huán)境之間的相互作用，旨在讓設(shè)計(jì)的移植物更加的“智能化”、“功能化”，更加關(guān)注并把握移植的材料和細(xì)胞在宿主體內(nèi)經(jīng)歷的生命過程。學(xué)者們從結(jié)構(gòu)、成分、力學(xué)特性的角度出發(fā)，使組織工程支架更加貼近天然組織，以提供更加合適的細(xì)胞微環(huán)境。同時(shí)，組織特異性干祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)給骨腱界面的研究帶來更多可能性，在骨腱界面中存在著特異性干細(xì)胞，利用這些內(nèi)源性干細(xì)胞能夠更加高效地促進(jìn)骨腱界面的損傷修復(fù)，這也是未來研究的方向之一。有一點(diǎn)我們可以確定的是，制備更高程度仿生的組織工程移植物是實(shí)現(xiàn)骨腱界面有序再生的重要手段。同時(shí)多學(xué)科的交叉整合同樣也是組織工程發(fā)展的必要途徑，相信通過實(shí)現(xiàn)對(duì)天然骨腱界面結(jié)構(gòu)和成分的高度模擬，實(shí)現(xiàn)骨腱界面損傷后的原位有序再生將不再是鏡中之花，水中之月。