不同提取方法對紫蘇籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響

范三紅，賈槐旺，張錦華，李蘭，白寶清*

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006；2.特色植物資源研究與利用山西重點實驗室(山西大學(xué))，太原 030006)

紫蘇是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物[1]，在我國有近2000年的栽培史，主要分布于四川、陜西、寧夏等省[2]。紫蘇籽是紫蘇的種子，其蛋白質(zhì)含量為20%～23%，紫蘇籽粕蛋白含量可達到28%～45%。紫蘇籽粕蛋白氣味優(yōu)良、適口性好，不存在對人體有害的成分；氨基酸的組成豐富，共含有18種氨基酸，其中包含8種人體必需氨基酸，是氨基酸種類齊全的完全蛋白質(zhì)。目前我國紫蘇籽粕最大的流向依然是作為畜禽飼料使用，開發(fā)、利用和深加工仍不完善，這對紫蘇蛋白資源造成了巨大的浪費。因此，綜合開發(fā)利用紫蘇蛋白資源、減少資源浪費以及提升經(jīng)濟效益成為當(dāng)前亟需解決的問題。

蛋白的常用提取方法有等電點法(堿溶酸沉法)、鹽析法、氯醋酸-丙酮沉淀法等。堿溶酸沉法具有操作簡便、損耗低、純度高和方便快捷等優(yōu)點[3]。石瑋婷等[4]研究了紫蘇籽蛋白的提取工藝，并對分離蛋白進行了超濾純化，最終獲得純度和提取率分別為91.74%和46.90%的分離蛋白。閃提是利用機械剪切力、快速攪拌和超動分子滲透技術(shù)來達到快速提取物料活性成分的目的，用時短、效率高是其最突出的特點和優(yōu)勢[5]。李雅松等[6]通過閃式提取法對栗葉蛋白的提取工藝進行了優(yōu)化，結(jié)果耗時3.6 min得到純度為64.89%、得率為11.89%的栗葉蛋白。超聲提取是利用聲波產(chǎn)生高速強烈的空化效應(yīng)，通過破壞物料的細胞，使溶劑滲透到物料細胞中，縮短提取時間，提高提取率。姜文鑫[7]研究了紫蘇蛋白的提取工藝和性狀表征，最終得到得率和純度分別為36.5%、86.9%的紫蘇蛋白。目前關(guān)于閃式提取和超聲提取對紫蘇籽粕分離蛋白功能性質(zhì)影響的研究鮮有報道。

本研究通過對比閃式提取和超聲提取紫蘇籽粕分離蛋白的功能性質(zhì)，以期為紫蘇籽粕蛋白資源的回收、開發(fā)和利用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽粕(產(chǎn)地：山西省晉城市陵川西河底鎮(zhèn)，品種：單面紅)，其他均為常規(guī)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-20V實驗型閃式提取器 河南智晶生物科技股份有限公司；SK-1030超聲波清洗儀 東莞市彭宇電子設(shè)備有限公司；868 pH測試儀 美國奧立龍公司；SP-2000UV紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離蛋白提取率計算

采用考馬斯亮藍法，根據(jù)公式(1)計算。

公式(1)

式中：X為分離蛋白提取率(%)，c為分離蛋白濃度(mg/mL)，N為稀釋倍數(shù)，V為分離蛋白溶液體積(mL)，m為樣品質(zhì)量(mg)，w為蛋白質(zhì)量分數(shù)(%)。

1.3.2 紫蘇籽粕蛋白的提取流程

紫蘇籽粕→去雜、粉碎、過篩、脫脂→配制成一定料液比→調(diào)節(jié)pH→超聲提取/閃式提取→離心機去渣→取上清液調(diào)節(jié)pH為等電點→離心→蛋白質(zhì)沉淀→真空冷凍干燥→密封低溫保存。

1.3.3 閃式提取和超聲提取分離蛋白單因素試驗

閃式提取確定料液比1∶20(g/mL)、閃提轉(zhuǎn)速3000 r/min、閃提時間30 s、閃提pH 10為基礎(chǔ)提取條件，以分離蛋白提取率為考察指標分別考察了閃提pH(8，9，10，11，12)、閃提時間(10，20，30，40，50 s)、閃提速率(1000，2000，3000，4000，5000 r/min)及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)4個因素對蛋白提取率的影響。超聲提取確定料液比1∶20、堿提溫度40 ℃、堿提時間30 min、堿提pH 10為基礎(chǔ)提取條件，以分離蛋白提取率為考察指標分別考察了堿提 pH(8，9，10，11，12)、堿提時間(15，20，25，30，35 min)、堿提溫度(30，40，50，60，70 ℃)及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)4個因素對蛋白提取率的影響。

1.3.4 閃式提取和超聲提取分離蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，閃式提取選取A閃提時間(20，30，40 s)、B料液比(1∶15、1∶20、1∶25，g/mL)、C閃提pH(9，10，11)3個主要影響因素為獨立變量；超聲提取選取A料液比(1∶15、1∶20、1∶25，g/mL)、B堿提pH(9，10，11)、C堿提時間(15，20，25 min)3個主要影響因素為獨立變量，以蛋白提取率為響應(yīng)值設(shè)計3因素3水平試驗方案[8-10]。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

取3 mL蛋白溶液，加入1 mL DPPH·乙醇溶液(40 μg/mL)，避光放置30 min，測定吸光度A1(517 nm)；3 mL蛋白溶液和1 mL乙醇溶液(40 μg/mL)混合，測定吸光值A(chǔ)2；3 mL乙醇和1 mL DPPH·乙醇溶液(40 μg/mL)混合測定吸光度值A(chǔ)0；以Vc為陽性對照并按公式(2)進行計算[11]。

公式 (2)

1.3.5.2 超氧陰離子清除能力的測定

依次加入pH 8.2的Tris-HCl緩沖液6 mL和3 mL蛋白溶液，37 ℃恒溫10 min，加入1 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L)，反應(yīng)4 min，用0.5 mL的鹽酸(0.5 mol/L)結(jié)束反應(yīng)，測吸光度值(320 nm)A1，以蒸餾水代替蛋白溶液和鄰苯三酚分別測吸光度A0和A2；以Vc為陽性對照并按公式2進行計算[12]。

1.3.5.3 羥自由基清除能力的測定

加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)溶液、1 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、1 mL蛋白溶液，最后加入1 mL H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，在510 nm處測定吸光度A1；用蒸餾水分別代替H2O2和蛋白溶液測定吸光度A2和A0；以Vc為陽性對照并按公式(2)進行計算[13]。

1.3.5.4 ABTS自由基清除能力的測定

加入0.1 mL蛋白溶液、3.9 mL ABTS工作液，混勻精確反應(yīng)6 min，在734 nm下測定吸光度值A(chǔ)1；以無水乙醇和蒸餾水分別代替工作液和蛋白溶液測定吸光度值A(chǔ)2和 A0；以Vc為陽性對照并按公式(2)進行計算[14]。

1.3.5.5 還原力的測定

將1 mL的蛋白溶液、1 mL磷酸緩沖液(pH 6.6)和1 mL鐵氰化鉀(1%)混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，加入1 mL三氯乙酸(10%)，3000 r/min離心10 min，將2 mL上清液、2 mL蒸餾水和1 mL三氯化鐵(0.1%)混勻，反應(yīng)10 min，在700 nm處測定吸光度[15]。

1.3.6 SDS-PAGE

分離膠和壓縮膠分別采用12%和5%，1 mg蛋白粉溶解于1 mL緩沖液中，100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫，2500 r/min離心2 min，取上清液15 μL加樣。采用分子量范圍為14.4～97.4 kDa的低分子量蛋白質(zhì)Marker。恒壓(25 V)下跑膠完成后，染色，脫色[16]。

1.3.7 分離蛋白功能性質(zhì)分析

1.3.7.1 溶解度

配制10 mg/mL的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH，室溫下渦旋10 min，離心15 min，上清液蛋白質(zhì)含量通過考馬斯亮藍法測定，樣品中蛋白質(zhì)含量用微量凱氏定氮法測定[17]。溶解度按公式(3)計算。

公式 (3)

1.3.7.2 持水性

稱取1 g凍干蛋白粉表示為m1，裝入預(yù)先稱重的離心管(m0)中，加入10 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，渦旋1 min，靜置30 min，4500 r/min 離心15 min。倒出上清液，再次稱重離心管質(zhì)量m2，按公式(4)計算每克樣品水或油的保持量[18]

持水性(g/g)=m2-m1-m0。

公式(4)

式中：m0表示離心管質(zhì)量；m1表示樣品質(zhì)量；m2表示持水后的總質(zhì)量。

1.3.7.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性

將8 mL的大豆油加入到24 mL的蛋白質(zhì)溶液(0.1%)中，調(diào)節(jié)pH，2000 r/min均質(zhì)1 min，形成均勻的乳液。均質(zhì)結(jié)束0 min和結(jié)束10 min后分別取50 μL的乳液，加入到一個含有5 mL SDS溶液(0.1%)的試管中，在500 nm處測定吸光值[19]，乳化性及乳化穩(wěn)定性分別按公式(5)和公式(6)計算。

公式(5)

公式(6)

式中：T=2.303；C為蛋白質(zhì)溶液的濃度；φ為油相的體積比；A0為0 min時在500 nm處的吸光值；A10為10 min時在500 nm處的吸光值。

1.3.7.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性

將30 mL蛋白液(10 mg/mL)裝入100 mL刻度管中，調(diào)節(jié)pH，2000 r/min分散1 min，記錄分散前后的體積，按公式(7)計算。泡沫穩(wěn)定性為儲存30 min后的穩(wěn)定性[20]，按公式(8)計算。

公式(7)

公式(8)

式中：V1為攪打前溶液的體積；V2為攪打后的總體積；V3為攪打30 min后的體積。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用Origin 8.5軟件繪制圖表，采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設(shè)計及分析，結(jié)果以x±s表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料成分分析

經(jīng)測定，PSM的蛋白、脂肪、水分、灰分含量分別為57.31%、8.94%、5.21%、7.64%；等電點為pH 4.2。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗

pH在8～10時，分離蛋白提取率隨著pH的增加而升高(見圖1中A)，可能是因為分離蛋白的主要組成成分為堿性蛋白，堿性提取環(huán)境有利于分離蛋白的溶解，進而提高提取率。當(dāng)pH為10時，提取率達到最大，繼續(xù)增大pH，分離蛋白提取率逐漸降低，推測其原因是強堿導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的變性，從而降低了蛋白提取率。提取時間在15～20 min時間段(見圖1中B)，提取率不斷升高，這是因為增加堿提時間可使物料中的蛋白充分溶解出來；時間為20 min時，提取率達到最大值42.9%。繼續(xù)增加堿提時間，提取率降低，其原因是提取時間過長導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而降低了蛋白的提取率。由圖1中C可知，當(dāng)堿提溫度在30～50 ℃時，蛋白提取率不斷升高，50 ℃時提取率達到最大，這是因為升高溫度會加速物料中分子的運動，加快物料分子的擴散，從而有利于蛋白質(zhì)的溶出。繼續(xù)升高溫度，提取率逐漸下降，因為高溫使得蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而引起了提取率的降低。當(dāng)料液比小于1∶20時，提取率與料液比成正相關(guān)(見圖1中D)，料液比為1∶20時，提取率達到最大值30.7%；這是因為適量增加溶劑會增大蛋白與溶劑之間的接觸面積，從而提高了蛋白的溶出率；繼續(xù)增大料液比，提取率降低，這是因為蛋白質(zhì)的溶出已經(jīng)比較充分；繼續(xù)增大料液比，非蛋白組分不斷溶出，提取體系擴大，產(chǎn)生了對蛋白酸沉淀不利的影響，導(dǎo)致提取率下降且增加了水資源的損耗。由單因素試驗結(jié)果可知，選取pH 10、堿提時間20 min、溫度50 ℃和料液比1∶20為最佳超聲提取單因素。

圖1 超聲提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗Fig.1 Single factor experiment of ultrasonic extraction of perilla seed meal protein注：A，B，C，D分別為堿提pH、堿提時間、堿提溫度、料液比對紫蘇籽粕蛋白提取率的影響。

2.2.2 閃式提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗

在測試pH范圍內(nèi)，當(dāng)pH為8～10時，提取率隨著pH的增大而升高(見圖2中A)；當(dāng)pH為10時提取率為46.2%，達到最大值。pH為10～12時，提取率快速下降，可能是強堿導(dǎo)致蛋白開始變性，閃提加快了蛋白分子與強堿的接觸，使蛋白質(zhì)的變性速率增快，導(dǎo)致提取率下降。閃提時間在10～30 s時間段，提取率隨著這時間的增加不斷升高(見圖2中B)；閃提時間為30 s時提取率達到最大值45.8%。繼續(xù)延長閃提時間，分離蛋白的提取率開始緩慢下降，可能是由于原料蛋白達到限定條件下的最大溶解且與提取液充分接觸，提取率已無上升空間，而隨著閃提時間延長，高速運轉(zhuǎn)的閃提器轉(zhuǎn)子與提取物摩擦產(chǎn)生的高溫使得料液溫度升高進而導(dǎo)致部分蛋白因高溫產(chǎn)生變性。在閃提速率1000～3000 r/min范圍內(nèi)，提取率隨著閃提速率的增加而升高(見圖2中C)，這是因為不斷增速的閃提進一步加速了蛋白的溶解；當(dāng)閃提速率達到3000 r/min時，提取率達到最大值44.9%。繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，高轉(zhuǎn)速加快了轉(zhuǎn)子與提取物的摩擦，導(dǎo)致料液溫度升高，高溫使部分蛋白質(zhì)開始變性，從而使得提取率開始逐漸降低。在測試料液比范圍內(nèi)，以1∶20為分界點(見圖2中D)，分離蛋白提取率先逐漸升高后逐漸降低，這是因為隨著料液比的增大，蛋白與提取液的接觸面積增大，加速了蛋白的溶解，從而使得提取率不斷增加；繼續(xù)增大料液比，提取體系變大，短時間的閃提操作不能使得蛋白完全溶出，從而導(dǎo)致分離蛋白提取率不升反降。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH 10、堿提時間20 min、閃提速率3000 r/min和料液比1∶20為最佳閃式提取單因素。

圖2 閃式提取紫蘇籽粕蛋白單因素試驗Fig.2 Single factor experiment of flash extraction of perilla seed meal protein注：A，B，C，D分別為閃提pH、閃提時間、閃提速率、料液比對紫蘇籽粕蛋白提取率的影響。

2.3 閃式提取和超聲提取紫蘇籽粕蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析紫蘇籽粕蛋白提取率，超聲提取各因素料液比、堿提pH和堿提時間分別為1∶20.79 (g/mL)、10.62和20.92 min時，預(yù)測紫蘇籽粕分離蛋白提取率為54.02%。結(jié)合實際操作的可行性，修正提取條件料液比、堿提pH和堿提時間依次為1∶20(g/mL)、10和20 min，在此優(yōu)化條件下進行3次重復(fù)驗證試驗，結(jié)果表明，提取率穩(wěn)定在(53.85±0.21)%；閃式提取各因素料液比、閃提pH 和閃提時間分別為1∶19.08 (g/mL)、10.17和30.19 s，預(yù)測分離蛋白提取率為46.78%?？紤]到操作的可行性，修正提取條件料液比、閃提pH和閃提時間依次為 1∶20(g/mL)、10和30 s，在修正條件下進行3次平行試驗，結(jié)果表明紫蘇籽粕蛋白提取率穩(wěn)定在(46.54±0.17)%。

2.4 抗氧化能力測定

2.4.1 清除DPPH自由基能力測定

由圖3可知，分離蛋白濃度在0.2～1.0 mg/mL的遞增過程中，UEOPI、FEOPI和Vc的DPPH自由基清除率均顯著升高后趨于平穩(wěn)。當(dāng)質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時，UEOPI、FEOPI和Vc的DPPH自由基清除率依次達到80.00%、71.09%、91.31%，表明兩種被測蛋白都具有較強的DPPH自由基清除能力，UEOPI的DPPH自由基清除能力略優(yōu)于FEOPI。

圖3 兩種分離蛋白和Vc對DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging ability of two separate proteins and Vc on DPPH free radicals

2.4.2 超氧陰離子清除能力測定

由圖4可知，被測質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，陽性對照Vc的超氧陰離子清除率先增加后趨于平穩(wěn)，而UEOPI和FEOPI的超氧陰離子清除率變化較小。當(dāng)質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時，UEOPI、FEOPI和Vc的超氧陰離子自由基清除率分別為24.89%、20.01%、99.11%，表明兩種被測蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力均較弱，UEOPI的超氧陰離子自由基清除能力略高于FEOPI。

圖4 兩種分離蛋白和Vc對超氧陰離子的清除能力Fig.4 The scavenging ability of two separated proteins and Vc on superoxide anion free radicals

2.4.3 羥自由基清除能力測定

由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，陽性對照Vc的羥自由基清除率不斷接近100%，而UEOPI和FEOPI的清除率緩慢上升。當(dāng)質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時UEOPI、FEOPI和Vc的羥自由基清除率分別為31.22%、20.93%、99.31%。兩種被測蛋白對羥自由基的清除能力均較弱且UEOPI的羥自由基清除能力略優(yōu)于FEOPI。

圖5 兩種分離蛋白和Vc對羥自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of two separate proteins and Vc on hydroxyl free radicals

2.4.4 ABTS自由基清除能力測定

由圖6可知，被測質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的不斷增加，3種被測樣品的ABTS自由基清除率均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時UEOPI、FEOPI和Vc的ABTS自由基清除率依次達到22.64%、18.14%、47.19%，表明兩種被測蛋白對ABTS自由基的清除能力相對較弱。在測試濃度范圍內(nèi)，較FEOPI而言，UEOPI有更強的ABTS自由基清除能力。

圖6 兩種分離蛋白和Vc對ABTS自由基清除能力Fig.6 The scavenging ability of two separate proteins and Vc on ABTS free radicals

2.4.5 還原力的測定

由圖7 可知，在被測濃度范圍內(nèi)，兩種被測蛋白的還原力明顯低于Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度達到1 mg/mL時，UEOPI、FEOPI和Vc的吸光度分別為0.389，0.271，1.417，表明兩種被測蛋白的還原力均較弱且UEOPI比FEOPI有更強的還原力。

圖7 兩種分離蛋白和Vc的還原力Fig.7 The reducing power of two isolated proteins and Vc

2.5 SDS-PAGE電泳分析

由圖8可知，UEOPI與FEOPI均有3條較明顯的條帶，而大豆分離蛋白的圖譜中有6條。兩種輔助方法提取的紫蘇籽粕蛋白亞基的分子量分布范圍大致相同。大豆分離蛋白亞基的分子量主要分布在14.4～80 kDa，而樣品蛋白主要分布在14.4～50 kDa，表明大豆分離蛋白的平均分子量要大于兩種輔助方法提取的蛋白。SDS-PAGE圖譜顯示，在20.0～31.0 kDa范圍內(nèi)，UEOPI比FEOPI多了兩條淺色條帶，表明兩種輔助方法提取的分離蛋白在組成成分上有了微小的差異，UEOPI的蛋白組成成分更豐富。

圖8 超聲提取和閃式提取分離蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.8 SDS-PAGE electrophoretogram of ultrasonic extraction and flash extraction of protein isolates注：M為小分子量蛋白Marker，B為大豆分離蛋白，1為超聲提取蛋白，2為閃式提取蛋白(標準蛋白從上至下的蛋白條帶分別是：兔磷酸化酶97.4 kDa、牛血清蛋白66.2 kDa、兔肌動蛋白43 kDa、牛碳酸酐酶31 kDa、胰蛋白酶抑制劑20.0 kDa、雞蛋清溶菌酶14.4 kDa)。

2.6 蛋白質(zhì)功能性質(zhì)分析

2.6.1 溶解性

由圖9可知，兩種蛋白的NSI變化趨勢較一致，當(dāng)pH為4.2時，UEOPI和FEOPI的溶解度分別達到最低的13.52%、11.25%。pH在遠等電點端的溶解性要大于近等電點端，因為當(dāng)pH小于4.2時，蛋白質(zhì)分子主要以正離子狀態(tài)存在；當(dāng)pH大于4.2時，主要以負離子狀態(tài)存在，隨著電荷不斷增多，分子間相互排斥，靜電斥力不斷增強，從而導(dǎo)致溶解度不斷升高。UEOPI的溶解度整體高于FEOPI，可能是超聲的空化作用能夠破壞蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子展開，與水的接觸面積增大，從而導(dǎo)致溶解度增加[21]。

圖9 pH對兩種蛋白溶解性的影響Fig.9 The effect of pH values on the solubility of two proteins

2.6.2 持水性

由圖10可知，以等電點4.2為分界點，當(dāng)pH在2～4.2變化時，兩種蛋白的WHC均下降，當(dāng)pH 在4.2～12時，WHC均開始上升。因為蛋白質(zhì)之間的相互作用大于蛋白質(zhì)與水之間的作用力時持水性降低，反之則持水性升高。等電點時蛋白質(zhì)呈現(xiàn)最低的水合作用，遠離等電點時，靜電荷和排斥力的增加使蛋白質(zhì)的持水力增大。UEOPI的持水力要高于FEOPI，因為超聲提高了蛋白質(zhì)與水之間的作用力，進而增大了其持水的能力。

圖10 pH對兩種蛋白持水性的影響Fig.10 The effect of pH values on the water holding capacity of two proteins

2.6.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

由圖11可知，以等電點4.2為分界點，兩種蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性均先降低后升高。當(dāng)pH在等電點4.2時，UEOPI和FEOPI的乳化性分別達到最低的15%、16.25%，乳化穩(wěn)定性分別達到最低的38.02%、40.34%。當(dāng)pH為12時，UEOPI和FEOPI的乳化性達到最高的48.25%和43.56%，乳化穩(wěn)定性達到最高的93.41%和90.31%。因為當(dāng)pH遠離等電點時，分離蛋白氨基酸側(cè)鏈的解離受到影響，產(chǎn)生了有利于乳濁液中穩(wěn)定的靜電斥力，使乳化性和乳化穩(wěn)定性增強[22]。UEOPI的乳化性高于FEOPI，UEOPI的乳化穩(wěn)定性略高于FEOPI，可能是超聲的空穴效應(yīng)會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)釋放出小分子亞基與肽，導(dǎo)致蛋白液的乳化活性升高[23]。超聲處理后的蛋白體系構(gòu)象更穩(wěn)定，蛋白粒子減小更易解折疊及快速在油-水界面上穩(wěn)定，因此乳化穩(wěn)定性升高[24]。

圖11 pH對2種蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.11 The effect of pH values on the emulsification and emulsification stability of two proteins

2.6.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性

由圖12可知，在被測pH范圍內(nèi)，以等電點pH 4.2為分界點，兩種蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性變化趨勢均先下降后升高。當(dāng)pH在2～4.2時，起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨著pH的升高而減??；當(dāng)pH為等電點4.2時，UEOPI和FEOPI的起泡性分別為10.36%和9.89%；泡沫穩(wěn)定性分別為64.52%和60.89%。當(dāng)pH在4.2～12時，起泡性隨著pH的升高而增加。因為蛋白質(zhì)的溶解性對它的起泡性有非常大的影響，pH值的變化改變了分離蛋白所帶電荷的狀態(tài)和數(shù)量，引起了其溶解度的變化，從而改變了蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。UEOPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于FEOPI，原因是超聲作用使蛋白質(zhì)內(nèi)疏水基團暴露，降低了氣-水界面的表面張力，有效改善了蛋白的起泡性[25]；超聲波作用可使蛋白質(zhì)變形、展開，暴露出更多疏水區(qū)域，提高了泡沫穩(wěn)定性。

圖12 pH對2種蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.12 The effect of pH values on the foamability and foaming stability of two proteins

3 結(jié)論

UEOPI和FEOPI的提取率分別為53.85%和46.54%，分離蛋白的純度依次為91.306%、93.923%，提取時間分別為20 min和30 s。UEOPI與FEOPI的SDS-PAGE電泳圖表明，兩種分離蛋白的分子量范圍均為14.4～50 kDa，但SDS-PAGE圖譜在20.0～31.0 kDa范圍內(nèi)UEOPI相對FEOPI多了兩條淺色條帶，表明UEOPI的蛋白組成更多樣。UEOPI比FEOPI有更好的DPPH、ABTS、O2-、OH自由基清除能力和還原力，有更高的NSI、WHC、EAI、ES、起泡性和起泡穩(wěn)定性。綜上所述，超聲輔助提取紫蘇籽粕蛋白在功能性質(zhì)方面相比閃提輔助更有優(yōu)勢。