趙 茜，王安群，謝 剛，劉盛均

常規(guī)HE制片工作中，病理工作者使用相同的試劑及染色程序，但腸道杯狀細(xì)胞胞質(zhì)著色較重，而其他組織染色正常。腸道杯狀細(xì)胞是由腸黏膜基底干細(xì)胞分化而來，形似高腳杯，內(nèi)含黏液顆粒，HE染色通常呈淡藍(lán)色或空泡狀。由于腸道杯狀細(xì)胞核質(zhì)對比減弱，影響制片質(zhì)量，嚴(yán)重時需要重新制片、更換蘇木精試劑來達到滿意的染色效果。然而，重新制片及更換新試劑會增大工作量及成本，還會造成組織損耗。本實驗通過測量蘇木精pH值找出導(dǎo)致腸道杯狀細(xì)胞黏液著色重的原因，并進行調(diào)整達到良好的HE染色效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2021年1月1日～5月30日四川省綿陽市中心醫(yī)院病理科的石蠟組織25例，其中腸鏡組織、胃鏡組織、子宮頸組織、乳腺組織、闌尾組織各5例。賽默飛半自動切片機(HM340E)，漂片儀，櫻花(Tissue-Tek Prisma Plus)全自動染色機，蘇木精、伊紅染液購自寧波察微生物公司；蘇木精購自珠海貝索公司；phs-320酸度計、冰乙酸購自成都科隆公司；鹽酸購自重慶川東公司。

1.2 方法實驗室檢測6種不同情況下蘇木精pH值，取2例腸鏡組織分別切片6張，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后染色。染色步驟如下：蘇木精5 min、水洗30 s、分化5 s、水洗30 s、堿化10 s、水洗30 s、伊紅30 s，按75%、80%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明封固。6種不同情況下蘇木精染色，僅3號蘇木精HE染色核質(zhì)對比不清，胞質(zhì)藍(lán)染較重，網(wǎng)狀，其余核質(zhì)對比均清晰。因此，用3號蘇木精進行后續(xù)實驗(表1)。

表1 6種不同情況下的蘇木精pH值及腸鏡組織HE染色

將25例組織各切片3張，分為A、B、C三組，A組采用腸道杯狀細(xì)胞黏液著色較重的3號蘇木精試劑；B組采用冰乙酸調(diào)整pH值為2.49后的3號蘇木精試劑；C組采用鹽酸調(diào)整pH值為2.49后的3號蘇木精試劑，染色步驟同上，分批次在櫻花染色機內(nèi)進行染色。

2 結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，A組腸鏡組織杯狀細(xì)胞中出現(xiàn)較重的藍(lán)染，核質(zhì)對比不清(圖1)；闌尾組織中出現(xiàn)少量較淺的杯狀細(xì)胞黏液藍(lán)染，胃鏡、子宮頸、乳腺無異常著色。B組腸鏡組織杯狀細(xì)胞中無藍(lán)染，呈空泡狀，核質(zhì)對比鮮明(圖2)；胃鏡、子宮頸、乳腺、闌尾組織核質(zhì)對比鮮明，無異常著色。C組腸鏡組織杯狀細(xì)胞中無藍(lán)染，呈空泡狀，核質(zhì)對比鮮明(圖3)；胃鏡、子宮頸、乳腺、闌尾組織核質(zhì)對比鮮明，無異常著色。

①②

圖3 腸鏡組織染色(C組)：杯狀細(xì)胞中無藍(lán)染，呈空泡狀，核質(zhì)對比鮮明

3 討論

腸道杯狀細(xì)胞主要成分為酸性黏蛋白，蘇木精水溶液是一種強酸試劑，色離子在水溶液中為陽離子，帶正電荷。在不同環(huán)境下蘇木精染液的pH值發(fā)生變化，腸黏膜上皮杯狀細(xì)胞經(jīng)HE染色也會呈現(xiàn)不同的染色效果。當(dāng)蘇木精pH值為2.49時，腸道杯狀細(xì)胞黏蛋白大部分不著色；當(dāng)蘇木精pH值大于2.52時，其為藍(lán)色呈網(wǎng)狀，并隨著蘇木精pH值升高而加重；當(dāng)pH值為2.85時出現(xiàn)較重的藍(lán)染。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)著色原理分析，當(dāng)pH值為2.52時，腸道杯狀細(xì)胞分泌的酸性蛋白與蘇木精結(jié)合，發(fā)生酸式電離帶負(fù)電荷，其等電點(約2.52)偏低，易與蘇木精試劑結(jié)合，蘇木精試劑pH值升高是引起腸道杯狀細(xì)胞黏蛋白藍(lán)染的直接原因[1-2]。在闌尾組織中也存在杯狀細(xì)胞藍(lán)染現(xiàn)象，但與腸組織相比闌尾組織杯狀細(xì)胞量少，分泌的酸性黏蛋白較少，黏蛋白藍(lán)染較輕，對HE切片質(zhì)量影響較小。實際工作中，腸道杯狀細(xì)胞黏蛋白藍(lán)染的情況，隨著切片染色量增多呈逐漸加重的趨勢。在HE染色時切片脫蠟至水后，染色架和載玻片殘留的水分會進入蘇木精試劑，實驗用水pH值約7.05，水分的進入將導(dǎo)致蘇木精pH值隨著染片量增加而不斷升高，當(dāng)升高至2.54及以上時，腸道杯狀細(xì)胞中開始出現(xiàn)較多的黏液藍(lán)染。影響染色架和載玻片水分殘留量的主要因素：染色機的機械臂有無抖動功能、載玻片進入蘇木精試劑的速度以及載玻片的種類。當(dāng)染色機的機械臂無抖動功能、載玻片進入蘇木精試劑速度越快、載玻片種類引起的自身水分殘留越多，蘇木精試劑pH值升高將隨之加快。通過以上分析，在染色量比較大的實驗室，為了延長蘇木精的使用壽命，可用冰乙酸和鹽酸調(diào)整蘇木精pH值；其中冰乙酸比鹽酸更易操作。如果條件允許可以調(diào)整染色機程序，在脫蠟至水后增加一步空缸，避免染色架和載玻片過快進入蘇木精試劑，減少水分殘留，可根據(jù)各地氣候溫度進行調(diào)整，此操作步驟時間不宜過長，避免切片過于干燥造成不良染色。在選擇載玻片時，水分殘留情況也應(yīng)作為重要的考慮因素。在手工染色的實驗室為了延長蘇木精的使用壽命，也應(yīng)盡量避免過多的水分帶入蘇木精染液中。如果實驗室不具備調(diào)整pH值的條件，可以將出現(xiàn)腸道杯狀細(xì)胞不良染色的蘇木精試劑，用于婦科液基細(xì)胞染色或用于冷凍染色等。

綜上所述，本實驗通過調(diào)整蘇木精試劑pH值和延緩蘇木精pH值升高的方法，延長其使用壽命。蘇木精試劑在病理科比較常用，采用廠家配置好的成品，價格較高。了解蘇木精特性，更加合理有效使用蘇木精試劑，可有效提高制片質(zhì)量及降低病理科損耗。