倒刺鲃兩極蟲的宿主新記錄及其分子系統(tǒng)學(xué)研究

向 瑤 張金葉 趙元莙

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 動物生物學(xué)重慶市重點實驗室, 重慶 401331)

黏孢子蟲是一類個體微小結(jié)構(gòu)簡單的后生動物寄生蟲, 主要寄生于魚類, 有些種類能引起魚類宿主的病害[1—3], 嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致死亡[4—7]。其中兩極蟲科(Myxidiidae Thélohan), 1892黏孢子蟲與大多數(shù)黏孢子蟲類群不同, 具有最廣泛的宿主類群,該科的種類不僅能寄生于變溫動物(海、淡水魚類、兩棲類、爬行類)[8—12], 還能寄生于恒溫動物(鳥類、哺乳類)[13,14]。有些物種還能廣泛寄生于多種不同的宿主, 如李氏腸黏蟲(Enteromyxum leeiDiamant, Lom and Dykova), 1994的宿主已經(jīng)超過40種[15]。兩極蟲屬(MyxidiumButschli, 1882)隸屬黏體門(Myxozoa)、黏孢子蟲綱(Myxosporea)、雙殼目(Bivalvulida)、兩極蟲科(Myxidiidae)[16], 是兩極蟲科中種類最多的屬, 迄今已記錄的種類超過230種[9]。兩極蟲屬種類具如下特征: 2個孢子殼瓣,孢子呈紡錘形、梨形或橢圓形, 末端稍尖; 殼瓣表面光滑或具條紋, 孢子縫線直; 孢子的兩極端各具一個梨形或球形的極囊且極囊向兩端開口, 細(xì)長的極絲在極囊內(nèi)橫向盤曲; 孢子質(zhì)位于兩極囊之間。兩極蟲為典型的腔寄生類群, 絕大多數(shù)種類寄生于宿主的膽囊或泌尿系統(tǒng), 極少數(shù)可營組織寄生[2,17],個別組織寄生種類甚至能導(dǎo)致寄生部位出現(xiàn)空泡影響宿主發(fā)育和繁殖[18]。

胭脂魚(Myxocyprinus asiaticusBleeker, 1864),隸屬鯉形目(Cypriniformes)胭脂魚科(Catostomidae)胭脂魚屬(Myxocyprinus), 是胭脂魚科唯一分布在我國的特有種[19,20], 現(xiàn)已在我國馴化為養(yǎng)殖魚類,成為我國長江流域重要經(jīng)濟魚類之一[21,22]。胭脂魚是雜食性的底棲魚類, 在人工養(yǎng)殖過程中常與其他不同食性和不同水層棲息的魚類混養(yǎng)以充分利用不同水層的資源[23]。但混養(yǎng)易增加胭脂魚與其他不同魚類的密切接觸機會, 加大寄生蟲或其他病原傳播的風(fēng)險, 進而增高傳染性造成經(jīng)濟損失[24]。因此開展對胭脂魚的寄生蟲及其病害的研究也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚病防治的需要。

倒刺鲃兩極蟲(Myxidium spinibarbaChen,et al.), 2020年最初從中華倒刺鲃[Spinibarbus sinensis(Bleeker, 1871)]的膽囊中檢獲[25]。本研究檢獲的倒刺鲃兩極蟲分離自胭脂魚膽囊, 在對其重描述的基礎(chǔ)上, 結(jié)合其形態(tài)學(xué)與18S rDNA分子數(shù)據(jù), 比較分析寄生于不同宿主的倒刺鲃兩極蟲及其他相似種之間的分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系, 旨在為寄生胭脂魚的黏孢子蟲種類組成及兩極蟲的宿主多樣性積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黏孢子蟲樣本采集和鑒定

宿主魚于2019年10月11日從重慶北碚區(qū)某養(yǎng)殖基地(該養(yǎng)殖基地由8個8.35 m×5.66 m的養(yǎng)殖池相連, 且池水互通; 多種魚類以不同年齡、不同規(guī)格同池或者單獨輪養(yǎng)輪放)捕獲。共獲26尾無明顯病癥的胭脂魚帶回實驗室解剖并進行黏孢子蟲檢測, 其中4尾魚的膽囊檢獲到黏孢子蟲(感染率為15.4%)。黏孢子蟲收集、處理、測量和鑒定方法參照文獻(xiàn)[26]處理。

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

從上述同一批次不同胭脂魚個體的膽囊內(nèi)分離獲得游離黏孢子蟲, 加入95%的乙醇溶液置于1.5 mL離心管保存。從離心管底部吸取10 μL黏孢子蟲液體, 用超純水清洗2—3次, 離心(2000 ×g)沉淀后用于DNA提取?；蚪MDNA的提取嚴(yán)格參照DNeasy Blood & Tissue試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)說明書執(zhí)行, 將提取的基因組DNA置于-20℃保存、備用。黏孢子蟲18S rDNA序列通過PCR技術(shù)利用引物18e: 5′-CTGGTTGATCCTGCC-3′[27]和18R: 5′-CTACGGAAACCTTGTTACG-3′[28]擴增。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[29]。取3 μL擴增產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測, 目的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(OMEGA, 美國)回收并送到上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究獲得的序列, 在GenBank中用BLAST進行同源序列檢索比對。根據(jù)比對結(jié)果, 選取12條高同源性序列(序列相似度高于89%), 24條先前相關(guān)研究所用序列[25]及本研究所獲的2條序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。另以Tetracapsuloides bryosalmonae(KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(KF731691)為外群, 利用Mr Bayes 3.2.6[30]選用最優(yōu)擬合模型(GTR)運行1000000代構(gòu)建Bayes(BI)樹, 利用在線軟件CIPRES Science Gateway V.3.3(http://www.phylo.org/)選用RAxML-HPC2 XSEDE(8.2.12)模型構(gòu)建ML(Maximum likelihood)樹。最后用FigTree v1.4和Adobe Photoshop CC軟件編輯注釋系統(tǒng)樹。將相關(guān)18S rDNA序列用MEGA 6.0[31]設(shè)置執(zhí)行K2P模型多序列比對計算出遺傳距離, 利用在線序列比對工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)計算得出兩兩序列相似度, 結(jié)合MEGA和Bioedit軟件完成變異位點分析。

1.4 主成分分析

使用PAST 3軟件進行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA), 對不同宿主寄生的倒刺鲃兩極蟲株系的孢子長、孢子寬、極囊長、極囊寬和極囊間距5項形態(tài)學(xué)特征進行形態(tài)計量學(xué)比較[32]。利用變異協(xié)方差矩陣生成置信度為95%的散射圖。

2 結(jié)果

2.1 倒刺鲃兩極蟲的形態(tài)學(xué)重描述

取宿主魚的適量膽汁制片鏡檢, 未見營養(yǎng)體和未成熟孢子, 但可見大量成熟孢子。成熟孢子殼面呈梭形, 兩端稍尖。孢子縫面呈卵圓形, 縫脊平直,孢子殼瓣上有7—10條與縫脊平行的條紋(圖 1)。孢子長為(12.59±0.56) μm (11.55—13.36 μm), 孢子寬為(5.92±0.40) μm (5.11—6.86 μm)。兩個極囊呈梨形位于孢子兩端, 大小相等, 其開口傾向孢子兩端。極囊長為(3.48±0.36) μm (2.63—4.22 μm), 極囊寬為(2.83±0.26) μm (2.29—3.21 μm)。兩極囊間隔(3.66±0.29) μm (3.12—4.20 μm), 極絲盤曲4—5圈(表 1)。

表1 寄生不同宿主的倒刺鲃兩極蟲的特征比較Tab. 1 Comparison among Myxidium spinibarba from different hosts

圖1 寄生于胭脂魚的倒刺鲃兩極蟲孢子顯微圖片F(xiàn)ig. 1 Photomicrographs of Myxidium spinibarba from Myxocyprinus asiaticus

2.2 18S rDNA分子特征和系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究從不同個體的胭脂魚樣本中獲得2條18S rDNA序列, 長度分別為1785(MT775466)和1913 nt (MT775467)。比對結(jié)果顯示, 所獲兩條18S rDNA序列之間相似度為100.00%, 在可比對長度(1785 nt)上無變異位點。兩條序列在NCBI中BLAST分析顯示: 與寄生于中華倒刺鲃的倒刺鲃兩極蟲(MH766654)的相似度最高, 為99.9%—100.0%,MT775467與Myxidium spinibarba(MH766654)在可比對長度范圍內(nèi)(1913 nt)僅有1個變異位點; 其次與Myxidiumsp.(MK913426)和Zschokkellasp.(KM 401441)具有較高相似度(表 2)。

表2 黏孢子蟲基于18S rDNA序列遺傳距離與相似度Tab. 2 Genetic distances and similarities of myxosporeans based on 18S rDNA sequences

基于18S rDNA序列構(gòu)建的ML和BI樹顯示出一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。兩棵系統(tǒng)樹均顯示: 所選取黏孢子蟲序列被分成A、B兩個大分支(圖 2)。A支是一混合支系, 包括寄生于爬行動物的兩極蟲、海水魚類的兩極蟲和楚克拉蟲及淡水魚類的兩極蟲和楚克拉蟲; 而B支則完全由寄生海水魚類的兩極蟲組成。本研究株系位于A支內(nèi), 其中株系(MT775466)與倒刺鲃兩極蟲(MH766654)聚支后, 再與株系(MT775467)聚支, 形成倒刺鲃兩極蟲支系; 然后, 與Zschokkellasp. (KM401441)和Myxidiumsp. (MK913426)亞支再形成了姐妹支。

圖2 基于18S rDNA序列構(gòu)建的BI/ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree generated by BI/ML based on 18S rDNA sequences

2.3 基于寄生不同宿主的倒刺鲃兩極蟲形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示本研究兩株系(MT775466和MT775467)與倒刺鲃兩極蟲(MH766654; 該株系原始數(shù)據(jù)來自本實驗室)在5項形態(tài)特征結(jié)合生成的橢圓散點圖上均有重合, 其中●株系(MT775466)散點圖基本覆蓋*株系(MH766654)散點圖, ▲株系(MT775467)的散點圖僅與前兩者的散點圖部分重疊(圖 3)。

3 討論

本研究兩株系形態(tài)學(xué)和生態(tài)學(xué)特性均顯示一致, 應(yīng)屬于同一物種。本研究獲得的兩極蟲, 兩端稍尖的梭形成熟孢子、平直的縫脊和殼瓣上的條紋數(shù)、兩個大小相等的梨形極囊、極絲圈數(shù)及極絲開口方向等形態(tài)學(xué)特征均與倒刺鲃兩極蟲的形態(tài)學(xué)特征一致[25], 且兩者的感染部位均為膽囊。同時, 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果也顯示: 盡管株系(MT775467)有略微的差異, 但本研究的2個株系的形態(tài)測量數(shù)據(jù)基本都與倒刺鲃兩極蟲的形態(tài)測量數(shù)據(jù)有大幅重疊(圖 3), 僅存在少許差異, 這樣的形態(tài)學(xué)量度差異在種內(nèi)變化范圍內(nèi)[33]。綜合形態(tài)學(xué)與主成分分析結(jié)果, 本研究獲得的兩極蟲與倒刺鲃兩極蟲當(dāng)屬同種。

圖3 寄生不同宿主倒刺鲃兩極蟲的孢子形態(tài)差異主成分分析Fig. 3 Principal component analysis on morphological differences of Myxidium spinibarba from different hosts

鑒于黏孢子蟲結(jié)構(gòu)簡單, 學(xué)者們在以往的研究中認(rèn)為在對黏孢子蟲進行物種鑒定和描述時, 應(yīng)當(dāng)綜合考慮該黏孢子蟲的形態(tài)學(xué)特征、生態(tài)學(xué)特征(宿主、寄生部位、地理分布)和分子特征[34,35]?；诖? 盡管本研究株系的宿主與原始描述宿主不同,但其18S rDNA序列比對結(jié)果顯示寄生胭脂魚的兩株系與中華倒刺鲃株系之間僅有1個變異位點, 遺傳距離和相似度分別為0.000—0.001和99.9%—100.0%, 符合已有研究給出的黏孢子蟲變異位點不超過10個, 遺傳距離在0.000—0.007, 相似度在98.6%—100%屬于種內(nèi)水平的判別標(biāo)準(zhǔn)[36—39]。分子特征分析也表明本研究所獲寄生胭脂魚的兩極蟲株系(MT77546和MT775467)與寄生中華倒刺鲃的倒刺鲃兩極蟲(MH766654)為同一物種。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示: 寄生不同宿主的倒刺鲃兩極蟲株系嵌合聚枝, 寄生胭脂魚的倒刺鲃兩極蟲株系(MT775467)先分化, 并與前述的主成分分析和18S rDNA特征分析結(jié)果表現(xiàn)一致。同種兩極蟲可在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的魚類宿主寄生, 這與已有的關(guān)于弧形蟲和腸黏蟲的研究有著明顯的一致性[33,40]。在本研究所顯示的倒刺鲃兩極蟲姐妹支中, 寄生于露斯塔野鯪[Labeo rohitaHamilton, 1822(鯉形目)]的Zschokkellasp.(KM401441)與寄生于長臀[Cranoglanis bouderiusRichardson, 1846(鲇形目)]的Myxidiumsp.(MK913426)形成高支持率(0.99/84)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系也得到了旁證: 盡管Zschokkellasp.(KM401441)與Myxidiumsp.(MK 913426)為不同種類且宿主親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 但顯示形態(tài)學(xué)特征較為相似, 都享有梭形的孢子并具有梨形極囊(圖 2)。兩極蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系與孢子形態(tài)、腔寄生的寄生部位趨向性等可能更相關(guān)。在通常情況下, 內(nèi)寄生蟲的進化在很大程度上受其與宿主相互作用的影響, 基于黏孢子蟲SSU rDNA的大數(shù)據(jù)集系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果認(rèn)為組織寄生物種是由類似祖先型的腔寄生黏孢子蟲進化而來[41,42]。寄生魚類的碘泡蟲類黏孢子蟲多為組織寄生, 是黏孢子蟲中進化較晚的類群[42]。絕大多數(shù)碘泡蟲類的黏孢子蟲寄生于淡水魚且具有明顯的宿主特異性乃至寄生部位特異性, 往往只感染一種宿主甚至只感染一種宿主的某一特定器官或組織[35]。而腔寄生的兩極蟲類是相對組織寄生的碘泡蟲類較為祖先的類群, 進化過程中分化形成海水支系和淡水支系, 其變異程度要比碘泡蟲等組織寄生類群更大,更易于對環(huán)境及宿主的變化形成適應(yīng)[41,42]。此外,先前基于魚體混養(yǎng)、受感染魚宿主的生活水體、經(jīng)口飼喂和肛門插管等途徑對李氏腸黏蟲傳播實驗研究表明, 李氏腸黏蟲可感染多種不同且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的魚類宿主[43], 也說明腔寄生的兩極蟲類黏孢子蟲對宿主具有更廣泛的適應(yīng)性。鑒于此, 推測本研究中倒刺鲃兩極蟲也可能具有多宿主特征, 能寄生多種不同宿主, 但這還需要更多研究予以證實。

綜上, 本研究首次在胭脂魚體內(nèi)檢獲黏孢子蟲,胭脂魚是倒刺鲃兩極蟲的新宿主; 寄生胭脂魚的倒刺鲃兩極蟲株系(MT775467)先分化。本研究也為寄生胭脂魚的黏孢子蟲種類組成積累了新的數(shù)據(jù)。