謝佩玲，張俐娜，何娜，南開輝

外傷性視神經(jīng)病變（TON）是顱腦外傷常見合并癥狀之一，在交通、高空墜落等事故中多見[1]。目前臨床對于間接性TON治療尚未達成共識，推薦治療方法有靜脈注射大劑量糖皮質(zhì)激素和經(jīng)顱或經(jīng)篩竇視神經(jīng)管減壓術(shù)，但神經(jīng)損傷修復再生治療效果不穩(wěn)定，治療效果不佳主要與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）存活數(shù)量以及軸突再生關系密切[2-3]。為改善TON患者的治療效果，研究者們致力于探索其他治療手段如基因治療、干細胞治療用于視神經(jīng)損傷修復再生，干細胞用于中樞神經(jīng)損傷治療作用在不同疾病模型研究中分別得到了證實[4-5]，然而，干細胞在TON 中的具體作用及其機制研究相對較少。本研究選擇大鼠視神經(jīng)夾傷模型，經(jīng)由玻璃體腔內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)細胞（BMSC），研究其對RGCs的保護及其軸突再生作用。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 細胞培養(yǎng)基DMEM/F 12（1∶1）（1X）、胎牛血清、胰酶（0.25% trypsin-EDTA）等購自美國Gibco 公司，死活染色試劑盒（Live/dead Viability assay）購自美國Invitrogen 公司，光學相干斷層掃描儀（OCT）購自美國Tissue-Tek 公司，Triton X-100 購自北京Solarbio 公司，氧氟沙星軟膏購自沈陽興齊眼藥有限公司，霍亂毒素B 亞基（CTB）購置美國Invitrogen 公司。實驗動物與分組：選取72 只健康SD大鼠，6～8 周齡，重量180～210 g，隨機分為3 組：TON+BMSCs 注射組（BMSCs 組）、TON+磷酸鹽緩沖溶液（PBS）注射組（PBS 組）和假手術(shù)組（Sham組），每組各24 只。BMSCs 組、PBS 組大鼠行眶內(nèi)段視神經(jīng)鉗夾傷造模，Sham 組只暴露視神經(jīng)。各組分別于造模后第3、7、14、28 天處死6 只大鼠。第25天在各組剩余的6 只大鼠玻璃體腔內(nèi)注射CTB。

1.2 方法

1.2.1 TON 模型建立 先將大鼠放入含3%異氟烷的氧氣、空氣（1∶1）混合氣體誘導箱內(nèi)誘導麻醉5 min，大鼠翻身反射消失后，繼續(xù)予含1.5%異氟烷的氧氣、空氣（1∶1）混合氣體經(jīng)面罩維持麻醉。大鼠置于手術(shù)臺，局部應用鹽酸丙美卡因滴眼液滴左眼予以表面麻醉處理。剃毛刀剔除眼瞼及眶周部分毛發(fā)，0.5%聚維酮碘溶液清潔備皮區(qū)及結(jié)膜囊，用角膜剪自左眼外眥處開始向顳側(cè)皮膚做長約6 mm的皮膚切口，注意勿損傷外眥靜脈等較大血管；使用5-0 絲線將切口兩側(cè)皮瓣縫合于切口兩側(cè)皮膚，牽拉暴露切口范圍。用角膜剪向結(jié)膜下穹窿部剪開結(jié)膜，暴露眶周脂肪并剪除遮擋視野部分，注意勿損傷眼外肌及血管；角膜剪剪除部分眶周脂肪，顯微鑷分離肌錐，暴露視神經(jīng)（封三彩圖3a）。在眼球后2 mm 處將顯微鑷（頭部寬度為0.1 mm，WA3010，中國金鐘）尖端完全閉合鉗夾視神經(jīng)持續(xù)6 s（封三彩圖3b～c）?？p合切口后涂抹眼膏防止感染，腹腔注射0.05 mg/kg 布洛芬鎮(zhèn)痛。BMSCs 組構(gòu)建TON 模型后玻璃體注射BMSCs，PBS 組構(gòu)建TON 模型后玻璃體注射PBS，Sham 組暴露視神經(jīng)后不做夾持處理。

圖3 經(jīng)顳側(cè)皮膚入路暴露視神經(jīng)并構(gòu)建視神經(jīng)鉗夾傷模型

1.2.2 BMSCs 培養(yǎng)與注射 另選取SD 大鼠2 只，重量80～100 g，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.5 ml麻醉，麻醉后心臟注入5 ml空氣處死，將大鼠浸泡于75%乙醇溶液中消毒5 min，移至超凈臺內(nèi)的干凈大培養(yǎng)皿中，分離出股骨、下肢骨，使用1 ml 注射器和BMSCs 專用培養(yǎng)基（含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)基）沖洗骨髓腔，收集至15 ml離心管中，1000 r/min 離心5 min，新鮮完全培養(yǎng)基重懸，接種于小培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。隔天換新鮮完全培養(yǎng)基，持續(xù)1 周，傳代至大培養(yǎng)瓶中，擴大培養(yǎng)2 代，選取細胞生長良好的P2 代進行后續(xù)試驗。BMSCs 組和PBS 組行玻璃體腔注射，Hamilton 微量注射器玻璃體腔內(nèi)分別注射BMSCs 5（l細胞密度為8000 個/ml）和PBS 5l。

1.2.3 RGCs 軸突順行標記與計數(shù) 使用裝配33 G尖針頭的10l Hamilton微量注射器，玻璃體內(nèi)注射5l 濃度為1 mg/ml 的CTB 594 溶液，3 d 后大鼠心臟灌注4%多聚甲醛，摘除眼球并使用4%PFA固定。顯微鏡下以視盤作為中心，將分離的視網(wǎng)膜放射狀剪成4 份，使用DM4B 正置熒光顯微鏡在200 倍下離視盤邊界1500m處4 個象限隨機拍照，用Image J 軟件計數(shù)每個區(qū)域的RGC 數(shù)量，并取4 個區(qū)域的平均值作為視網(wǎng)膜上RGC 的數(shù)量。

1.2.4 視神經(jīng)切片及新生軸突計數(shù) 解剖并固定視神經(jīng)，包埋、連續(xù)切片20 張后置于－20 ℃冰箱短期保存。使用Image J 軟件計數(shù)每張視神經(jīng)切片距離損傷灶起始處200、500、1000、1500m 處CTB 陽性再生軸突數(shù)量；每根視神經(jīng)選取3 張切片計數(shù)，并求出平均值。同時計數(shù)時測量神經(jīng)的橫截面寬度（2r），用于計算每毫米神經(jīng)寬度的軸突數(shù)目?！芶d 是半徑為r 的視神經(jīng)中軸突距離視神經(jīng)鉗夾損傷起始處距離為d 的部位再生軸突總數(shù)，通過對所有厚度為的視神經(jīng)切片根據(jù)下面公式求和計算而得出

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RGCs 計數(shù)情況比較 在各個時間點，BMSCs 組與PBS 組RGCs 存活數(shù)量均低于Sham組，而BMSCs 組RGCs 存活數(shù)量均高于PBS 組（均P ＜0.05），見表1 和封三彩圖4～6。

表1 各組RGCs 計數(shù)情況比較 個/mm2

圖4 Sham 組在各時間點視網(wǎng)膜鋪片

2.2 軸突生長情況 在距離視神經(jīng)夾傷起始部位200、500、1000、1500m 位置，BMSCs 組新生軸突數(shù)量高于PBS組（均P＜0.05），見表2；造模后4 周，BMSCs 組顯示有大量新生軸突穿過損傷部位，而PBS 組只有少量新生軸突，見封三彩圖7。

表2 各組軸突生長情況比較 根

圖7 玻璃體腔內(nèi)注射CTB后新生軸突情況比較

圖5 BMSCs 組在各時間點視網(wǎng)膜鋪片

圖6 PBS 組在各時間點視網(wǎng)膜鋪片

3 討論

外傷性視神經(jīng)病變往往造成急性的視神經(jīng)損傷，導致視力部分或全部喪失。視神經(jīng)鉗夾損傷是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷再生修復的重要模型之一，通過經(jīng)眼眶暴露視神經(jīng)，完全避免了對視神經(jīng)的牽拉。本研究結(jié)果表明單純經(jīng)眼眶暴露視神經(jīng)不會造成明顯RGCs 數(shù)量的損失。本研究結(jié)果還顯示視神經(jīng)損傷2 周后即有大量RGCs凋亡，而視神經(jīng)如果受到損傷，其再生能力遠遠低于周圍神經(jīng)。其原因如下：首先，RGCs作為高度分化細胞，在損傷后再生能力嚴重不足，這是視神經(jīng)難以再生的主要原因；其次，視神經(jīng)損傷后引起軸突潰變而斷裂，造成RGCs 繼發(fā)性凋亡；最后，視神經(jīng)損傷后軸突再生形成磷髓酯碎片、膠質(zhì)瘢痕等抑制性微環(huán)境嚴重阻礙了視神經(jīng)再生[7-8]。

視神經(jīng)再生包括以下幾個方面：（1）保護RGCs，避免視神經(jīng)損傷后的RGCs凋亡；（2）促使RGCs軸突沿視神經(jīng)方向再生，即軸突定向生長，視神經(jīng)損傷后，軸突斷裂，視神經(jīng)變性壞死失去功能，需要新生軸突重建功能；（3）重建新生軸突視覺信號傳導功能，即視功能重建。視神經(jīng)再生干細胞移植包括多功能干細胞以及間充質(zhì)干細胞。多功能干細胞通過誘導分化使其移行整合到宿主的視網(wǎng)膜上，補充凋亡的RGCs及生成新生的軸突；間充質(zhì)干細胞對損傷后的神經(jīng)元細胞給予炎癥調(diào)節(jié)、營養(yǎng)和神經(jīng)保護支持[10-11]。BMSCs 在醫(yī)學領域已經(jīng)得到廣泛的應用，其制備、質(zhì)量管理、存儲、運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)都較為成熟，為其在視神經(jīng)再生領域的應用提供了保障。

本研究觀察到視神經(jīng)損傷大鼠玻璃體腔內(nèi)注射一定量的BMSCs不僅可以提高RGCs的存活數(shù)量，同時也促進更多的新生軸突的生長。因此，玻璃體腔注射BMSCs 有可能成為外傷性視神經(jīng)損傷的新療法。但是，BMCs 促進RGCs 存活及促進軸突再生的機制需深入探討，且本研究觀察時間較短，未能重建新生軸突與腦靶區(qū)的連接及檢測視功能的重建情況，而這恰恰是神經(jīng)再生難點所在，其將是后續(xù)研究關注重點。