趙 海，于 聰，趙洪乾，李 婷，凌 云，齊佳瑞，陳 亮，吳 岳#

( 1.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001；2.青海省刑事警察總隊，青海 西寧 810001)

利用玻璃體液內物質濃度的變化推斷死亡時間(postmortem interval，PMI)是近年來的研究熱點。本課題探討在高海拔、不同溫度(T)下雄性大鼠溺死后玻璃體液(vitreous humor，VH)中的維生素C(Vit.C)、次黃嘌呤(Hx)、谷草轉氨酶(AST)和尿素(Urea)的濃度變化與早期PMI的關系。

1.材料與方法

1.1 實驗動物分組及取材方法

1.2 樣本檢測方法

檢測之前將樣本在室溫下解凍，取玻璃體液200 μL于檢測管中，使用美國貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析檢測儀檢測AST、Urea濃度。用移液槍吸取50 μL玻璃體液于上樣瓶中，應用安捷倫1260 Ⅱ高效液相色譜儀檢測Vit.C、Hx濃度。

1.2.1 高效液相實驗體系

1.2.2 實驗標準品的制備方法

Hx的相對分子質量為136.11，用電子天平稱量Hx的標準品，用移液槍提取純水配置0.100、0.050、0.010、0.005mg·mL-1的標準品，用水浴加熱溶解。Vit.C的相對分子質量為176.12，用電子天平稱量Vit.C的標準品，用移液槍提取純水配置0.200、0.100、0.050、0.025mg·mL-1的標準品。

1.2.3 Hx標準品高效液相色譜圖

Hx標準品高效液相色譜圖見圖1。

1.2.4 Vit.C標準品高效液相色譜圖

Vit.C標準品高效液相色譜圖見圖2。

圖2 VC標準品高效液相色譜圖

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行均數(shù)及標準差計算、單因素方差分析、Pearson及多元線性回歸方程分析，檢驗水準為α=0.05。

2.結果

2.1 玻璃體液內的AST濃度

大鼠死亡后在不同T條件下，隨著PMI的延長VH中AST的變化如表1與圖3所示。與對照組相比隨著PMI的延長AST濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(P<0.05)。0到6 h內AST呈上升趨勢，增長率分別為236%、189%、233%，隨T上升，AST濃度增長速度先降低后升高。其中0到3 h內上升最快，圖3顯示其斜率最大。4 ℃組在9 h時上升至最高點，此后逐漸下降，而20 ℃組與30 ℃組則在6 h時開始下降。在死亡9至24 h內AST的濃度在同一時間降低，其中4 ℃溫度組下降速度較平緩，而另外兩組下降速度更快且隨著T的升高下降速度增加，下降速度與T成正比。

表1 大鼠死后不同溫度玻璃體液AST濃度的測定結果

2.2 玻璃體液內的Urea濃度

大鼠死亡后在不同T條件下，隨著PMI的延長VH中Urea的變化的如表2與圖4所示。與對照組相比隨著PMI的延長Urea濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(P<0.05)。在0到3 h內濃度逐漸上升，20 ℃組增長速度最快，圖4顯示其斜率最大，三個溫度組在其間的增長速度分別為150%、411%、213%，隨著T升高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。Urea濃度在6、9、12、18、24 h下降，其中6至9 h內下降速度最快，下降速度隨著T升高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。在9至12 h內出現(xiàn)短暫平臺期，圖4顯示其濃度波動很小，此后濃度逐漸下降且下降速度近乎相同，圖4顯示其圖線幾乎平行。

圖4 大鼠死后不同溫度及時間下玻璃體液中Urea濃度變化圖

表2 大鼠死后不同溫度玻璃體液Urea濃度的測定結果

2.3 玻璃體液內的Hx濃度

以Hx標準品濃度為橫坐標、標準品峰面積為縱坐標，得出標準品方程為y=27.408x-33.709，r2=0.9952，由此可推出玻璃體液中Hx的濃度。大鼠死亡后在不同T條件下，隨著PMI的延長VH中Hx的變化如表3與圖5所示。與對照組相比隨著PMI的延長Hx濃度呈現(xiàn)先降低后上升再降低的趨勢(P<0.05)。在死亡0至3 h內Hx下降速度最快，圖5顯示其斜率變化最大，隨著溫度增高Hx濃度降低。4 ℃組與20 ℃組相比變化趨勢相同，0至9 h內濃度逐漸下降，9至18 h內濃度逐步升高后繼續(xù)下降，濃度變化的速率與溫度成正比。30 ℃組3 h時濃度降至最低點，3至9 h內濃度逐漸升高，上升階段相比最低點增長率為14%，而4 ℃組與20 ℃組則分別為34.4%與79.8%，上升速度隨著T增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，此后濃度再次下降，但在12 h之后濃度變化幅度較小，圖5顯示該時間段曲線趨于平緩。

圖5 大鼠死后不同溫度及時間下玻璃體液中Hx濃度變化圖

表3 大鼠死后不同溫度玻璃體液Hx濃度的測定結果

2.4 玻璃體液內的Vit.C濃度

以Vit.C標準品濃度為橫坐標、標準品峰面積為縱坐標，得出標準品方程為y=14.831x-46.843，r2=0.9998，由此可推出玻璃體液中Vit.C的濃度。大鼠死亡后在不同T條件下，隨著PMI的延長VH中Vit.C的變化如表4與圖6所示。與對照組相比，隨著PMI的延長Vit.C的濃度呈現(xiàn)先降低后上升再降低的趨勢(P<0.05)。在死亡0至3 h內Vit.C下降速度最快，圖6顯示其斜率變化最大，下降速度與T成反比。4 ℃組與20 ℃組在3至12 h內濃度波動幅度較小，圖6顯示該時間段逐漸平緩，12至18 h內濃度逐漸上升，相比于最低點增長率分別為45%、73%；30 ℃組在6 h時上升至最高點增長率為19%，此后濃度逐漸下降，12 h后趨于平緩。在早期死亡時間內，Vit.C的上升幅度隨T的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖6 大鼠死后不同溫度及時間下玻璃體液中Vit.C濃度變化圖

表4 大鼠死后不同溫度玻璃體液Vit.C濃度的測定結果

2.5 相關分析結果

Pearson分析結果見表5。

表5 PMI與濃度值的Pearson分析結果

2.6 曲線擬合相關分析結果

將不同T條件下的AST、Urea、Hx、Vit.C的濃度與PMI進行相關分析，其中以測定值為因變量y、PMI為自變量x作曲線相關擬合(二次、三次、復合曲線)得到的結果如表6所示。其中Urea、Vit.C在20 ℃時r2相對較高，說明在20 ℃時其與PMI相關性更好；AST、Hx在30 ℃時r2更高，說明在30 ℃時其與PMI相關性更好。綜上所述，在溫度為4 ℃時Vit.C的三次回歸方程r2較大，與PMI相關性更好；20 ℃時，Urea的三次回歸方程r2較大，用于PMI推斷更加準確；30 ℃時Hx的三次回歸方程r2較大，更適合用于PMI推斷。

表6 PMI與濃度值的回歸分析結果

3.討論

玻璃體液由水、蛋白質、無機鹽、脂質、尿素、葡萄糖、維生素等物質組成。因眼球解剖位置獨特，不容易受到污染，近年來擬通過玻璃體液內物質濃度的變化，探討與PMI關系的研究成為熱點[1]。因PMI推斷的指標物質在死后受眾多因素影響，在眾多影響因素中，外界溫度被認為是影響PMI推斷的最主要因素[2-4]。Ahra Go等[5]對已知PMI的尸體的VH進行了定量分析，同時用四季溫度進行分組并調查每個樣本死亡時的平均日環(huán)境溫度以校準與PMI的相關性，結果顯示Hx與PMI的相關性從0.53增加到0.59，L-乳酸的相關性從0.38增加到0.42。Rognum等[6]檢測尸體玻璃體液中的Hx濃度，顯示Hx的濃度與PMI呈正相關關系，顯示環(huán)境溫度對玻璃體液內的Hx濃度有較大影響。以上研究表明構建不同溫度條件下與PMI之間的多元回歸方程，可以提高其推測精確度。

西寧市海拔為2 261 m，屬于高海拔地區(qū)，早晚溫差大，氣候特征與內陸差異大需要進行差異化研究[7]。本實驗選擇常見低溫(4℃)、常溫(20℃)、高溫(30℃)進行實驗。

實驗結果顯示，溺死的雄性大鼠VH中AST、Urea、Vit.C、Hx的濃度與PMI呈負相關關系。其中Urea，Vit.C在20 ℃時三次回歸曲線擬合優(yōu)度相對較高，分別為0.950、0.782，說明在20 ℃時該物質的濃度變化與PMI的相關性更高；AST、Hx在30 ℃時擬合優(yōu)度更高，AST的復合回歸曲線擬合優(yōu)度為0.541，Hx三次回歸曲線擬合優(yōu)度為0.762，說明在30 ℃時與PMI相關性更好。對于擬合優(yōu)度，不同專業(yè)領域的人的要求不同，在對于玻璃體液成分代謝與PMI的關系中，有學者[8-9]認為具有應用價值的相關回歸方程其擬合優(yōu)度要大于0.9。在本實驗中只有20 ℃條件下的Urea滿足，擬合優(yōu)度為0.950>0.900。三個溫度組中Urea的Pearson分析結果皆大于0.7，屬于強相關，并且實驗中發(fā)現(xiàn)死后Urea前期的上升與T的升高造成VH內蛋白質代謝致氨增多有關，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，至9 h時基本下降至同一水平，而后至24 h時隨著T的升高，三組Urea的圖線呈現(xiàn)平行狀態(tài)，即9 h后T的變化并不能改變Urea的代謝速率。但由于未能考慮到環(huán)境濕度、死前損傷狀況、個體化差異等因素，其可能存在誤差。

綜上所述，高海拔環(huán)境下不同T對推斷溺死雄性大鼠的PMI有影響，Urea的三次回歸方程更適合20 ℃環(huán)境下對于PMI的推斷，Vit.C、AST、Hx也隨著PMI的延長呈現(xiàn)下降趨勢，可用作綜合推斷指標。大鼠與人的個體化差異明顯，相關規(guī)律能否應用于人體猶未可知。