張 寒，陳 輝，劉麗軍，張致英，楊雪林，渠敬鋒，馬福才，馬利鋒，康龍麗*

(1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712082；2.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712082；3.西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院，西藏 拉薩 850000)

高原人群長(zhǎng)期處于高原低壓低氧環(huán)境，會(huì)發(fā)生特有的慢性高原病(Chronic mountain sickness，CMS)——高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia，HAPC)[1]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，同一海拔地區(qū)西藏世居人群HAPC發(fā)病率顯著低于移居漢族人群，且女性患病率(1.9%)低于男性(3.4%)[2]。西藏世居人群可能存在高海拔低氧環(huán)境的適應(yīng)基因，以抵抗HAPC的發(fā)生。目前，已有多篇文獻(xiàn)認(rèn)為高原人群HAPC的發(fā)病與基因位點(diǎn)的變異有關(guān)，包括PPP1R2P1、SENP1、ANP32D、PIK3CD、EPAS1等[3，4，5]。結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道和課題組前期小樣本測(cè)序研究結(jié)果[6]，篩選出西藏世居人群發(fā)生HAPC可能的候選基因STAT3、STAT5A、RUNDC3B。本研究采取目標(biāo)區(qū)域靶向測(cè)序技術(shù)，探討STAT3、STAT5A、RUNDC3B候選基因多態(tài)性與西藏世居人群HAPC易感性的相關(guān)關(guān)系，為HAPC的遺傳機(jī)制研究提供依據(jù)。

1.對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)“青海標(biāo)準(zhǔn)”[1]，選擇同一時(shí)段在西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院及西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院就診的西藏世居者，并根據(jù)性別進(jìn)行分組研究。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：①男性Hb≥21 g/dL，女性Hb≥19 g/dL；②長(zhǎng)期居住在3 650米以上的高原地區(qū)；③排除真性和假性以及其他繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥。

兩所醫(yī)院共招募927名長(zhǎng)期居住于3 650米以上無(wú)血緣關(guān)系的志愿者，其中HAPC患者567例(男性455例，女性112例)，納入病例組；同期匹配健康對(duì)照者360例(男性248例，女性112例)，納入對(duì)照組。研究?jī)?nèi)容符合《赫爾辛基宣言》規(guī)定并經(jīng)西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 DNA提取方法

采集3 mL外周血液樣本，置于含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)抗凝的真空采血管中。使用血液基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd，Beijing，China)按照標(biāo)準(zhǔn)程序分離提取血液基因組DNA樣品。DNA純度和質(zhì)量通過(guò)Nanodrop One分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA，A260/A280為1.7～2.0)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳方法確認(rèn)：電泳條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯降解，且無(wú)RNA污染。合格樣本置-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因分型方法

根據(jù)目標(biāo)STAT3、STAT5A、RUNDC3B基因設(shè)計(jì)高質(zhì)量的測(cè)序引物，以DNA樣品基因組為模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。反應(yīng)采用11個(gè)循環(huán)數(shù)的PCR程序，盡可能降低PCR的傾向性。使用Illumina Hiseq(Illumina，CA，USA)平臺(tái)，以2×150 bp的雙端測(cè)序模式進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得基因測(cè)序數(shù)據(jù)。在567例HAPC組和360例對(duì)照組中，目的區(qū)域95%以上被覆蓋，STAT3、STAT5A、RUNDC3B基因的顯著相關(guān)基因型變異被分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS v 26.0軟件處理數(shù)據(jù)。為降低關(guān)聯(lián)分析中的假陽(yáng)性概率，以最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)≥0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，采用哈-溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)法進(jìn)行SNP質(zhì)量控制。SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析采用Pearson卡方檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn)，并在遺傳模型中使用Plink v 2.0軟件進(jìn)行非條件logistic回歸分析。多態(tài)性位點(diǎn)之間在遺傳過(guò)程中可能出現(xiàn)連鎖不平衡關(guān)系，使用 Haploview v 4.2軟件[7](https：//sourceforge.net/projects/haploview/)進(jìn)行連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)分析，以此獲得存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的單倍型域。使用GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.gtexportal.org/home)對(duì)顯著差異位點(diǎn)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為P<0.05。

2.結(jié)果

2.1 HWE檢驗(yàn)與MAF分布

所有樣本最終共檢測(cè)到11個(gè)SNPs位點(diǎn)，SNP位點(diǎn)在對(duì)照組中均符合HWE檢驗(yàn)(均HWE-P>0.05)。以單個(gè)位點(diǎn)為單位，比較各SNP位點(diǎn)的基本信息，見(jiàn)表1。

表1 候選基因SNPs位點(diǎn)基本信息

2.2 遺傳模型下SNPs位點(diǎn)與HAPC的關(guān)系分析

盡管候選基因SNPs位點(diǎn)在等位基因頻率上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在遺傳模型上分析了篩選出STAT3基因rs2293152位點(diǎn)基因型頻率和HAPC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在隱性模型下，STAT3基因rs2293152位點(diǎn)可能與HAPC患病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，攜帶基因型“G/G”個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)是攜帶基因型“C/C-C/G”的0.67倍(OR=0.67，95%CI=0.46-0.97，P=0.035)，但該位點(diǎn)經(jīng)過(guò)FDR校正或Bonferroni校正后，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PFDR=0.842，PBonferroni=1.000)，見(jiàn)表2。其余SNP位點(diǎn)在遺傳模型中沒(méi)有顯示出與HAPC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的顯著性差異。

表2 STAT3基因rs2293152位點(diǎn)與HAPC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性分析

2.3 連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

連鎖不平衡分析表明，RUNDC3B、STAT3、STAT5A基因SNPs位點(diǎn)均分別構(gòu)成了1個(gè)單倍型域，表現(xiàn)出顯著的連鎖不平衡，見(jiàn)圖1。然而，HAPC組和對(duì)照組之間每個(gè)單倍型域的單倍型頻率間沒(méi)有顯著性差異。

(A)STAT3基因；(B)STAT5A基因；(C)RUNDC3B基因

2.4 性別分層分析

按照受試對(duì)象的性別進(jìn)行分層，HAPC病例組中男性455例、女性112例；同期匹配的健康對(duì)照組中男性248例、女性112例。進(jìn)行遺傳模型分析、連鎖不平衡分析以及單倍型構(gòu)建，探究候選基因STAT3、STAT5A、RUNDC3B在性別分層后對(duì)HAPC的不同影響。結(jié)果顯示，各候選基因SNP位點(diǎn)在性別分層后無(wú)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異。

2.5 GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)分析

通過(guò)GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)分析，觀察到STAT3基因rs2293152位點(diǎn)“GG”基因型在健康人的心臟左心室(P=5.86e-3)及垂體(P=3e-2)中的表達(dá)存在差異，見(jiàn)圖2。

圖2 STAT3基因rs2293152位點(diǎn)在GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)的表達(dá)圖譜

3.討論

現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展使很多復(fù)雜疾病的遺傳機(jī)制得到進(jìn)一步闡明。HAPC是一種在高海拔地區(qū)特發(fā)的慢性高原疾病，與高原低氧低壓環(huán)境密切相關(guān)，但同一高海拔地區(qū)人群的發(fā)病率卻存在差異，說(shuō)明遺傳因素可能發(fā)揮一定作用。本研究對(duì)STAT3、STAT5A和RUNDC3B基因采用目標(biāo)區(qū)域靶向測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)STAT3基因rs2293152位點(diǎn)的“GG”基因型在隱性模型下能降低HAPC的患病風(fēng)險(xiǎn)，而STAT5A和RUNDC3B基因的多態(tài)性與HAPC患病風(fēng)險(xiǎn)可能無(wú)關(guān)。

造血過(guò)程中，各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在細(xì)胞周期檢查點(diǎn)中起著至關(guān)重要的作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)蛋白是一個(gè)由7個(gè)成員(STAT1～4，STAT5A/B和STAT6)組成的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子家族。每一個(gè)家族成員在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面都具有獨(dú)特的功能，在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)不同類型細(xì)胞因子的反應(yīng)方面扮演著重要角色[8]。人類STAT3基因位于染色體17q21.2區(qū)域，發(fā)生功能獲得性突變時(shí)會(huì)使患者表現(xiàn)為紅細(xì)胞生成障礙，引起血影蛋白缺乏癥，最終可能導(dǎo)致重度難治性溶血性貧血[9]。攜帶STAT3基因突變?cè)谕瑫r(shí)患有純紅細(xì)胞再生障礙性貧血和T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病的病人中很常見(jiàn)。靶向敲除STAT3基因的小鼠血液表型與過(guò)早衰老和骨髓增生性腫瘤(如紅系異常增生、貧血等)疾病的表型相似[10]。非磷酸化的STAT3具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞異染色質(zhì)形成、體外抑制細(xì)胞增殖以及抑制小鼠異種移植物中腫瘤生長(zhǎng)的功能[11]。造血系統(tǒng)中STAT3具有內(nèi)在的抗炎活性，能保護(hù)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞對(duì)抗炎癥和不適當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)反應(yīng)，對(duì)維持血液細(xì)胞譜系平衡至關(guān)重要[12]。缺氧條件下，細(xì)胞通過(guò)STAT3信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨質(zhì)缺損愈合，下調(diào)STAT3通路可抑制人骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡[13]。此外，許多研究者認(rèn)為鐵的失調(diào)與多種疾病有關(guān)，鐵可以通過(guò)激活CDK1/JAK1/STAT3信號(hào)通路引起腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖。巨噬細(xì)胞分泌因子通過(guò)STAT3信號(hào)誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)鐵調(diào)素的表達(dá)增加[14]。

內(nèi)脂素能影響血脂代謝調(diào)節(jié)，與缺氧、炎癥及血管增生等多種病理因素有著緊密聯(lián)系。Kaliora A等[15]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶STAT3 rs2293152 G等位基因能導(dǎo)致內(nèi)脂素(visfatin)水平顯著增加，對(duì)脂肪性肝病患者產(chǎn)生有益影響。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)STAT3基因rs2293152位點(diǎn)的“GG”基因型在隱性模型下能降低HAPC的患病風(fēng)險(xiǎn)。我們推測(cè)HAPC患者內(nèi)脂素水平可能也發(fā)生了一定變化，從而在缺氧環(huán)境中起到部分保護(hù)性作用。另一方面，STAT3基因rs2293152的具體作用機(jī)制尚不完全明確，對(duì)亞洲人群中的Meta分析顯示，STAT3基因rs2293152位點(diǎn)在隱性模型中與多種癌癥的發(fā)生有顯著性關(guān)聯(lián)(OR=1.19，95%CI=1.02-1.38)[16]。GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，STAT3基因rs2293152位點(diǎn)“GG”基因型在左心室和垂體中的表達(dá)存在差異，該位點(diǎn)可能間接影響左心室射血分?jǐn)?shù)，導(dǎo)致血容量發(fā)生一定變化，從而影響血氧含量。而垂體能調(diào)節(jié)雌激素分泌，雌激素在慢性缺氧條件下對(duì)紅細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)有重大影響[17]，這種影響對(duì)HAPC可能發(fā)揮某種遏制作用。

當(dāng)促紅細(xì)胞生成素與其受體結(jié)合時(shí)，受體相關(guān)JAK2信號(hào)通路會(huì)激活STAT5，使應(yīng)激性紅系組細(xì)胞增殖與分化[18]。STAT5A/B是一個(gè)緊密相關(guān)的染色體并列基因編碼，這兩種蛋白在正常的造血過(guò)程中都起著重要作用。其中STAT5A的磷酸化水平?jīng)Q定了紅細(xì)胞生成的速率，進(jìn)而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成，對(duì)造血干細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化起到一定的調(diào)節(jié)作用[19]。此外，STAT5A可以促進(jìn)增殖蛋白的產(chǎn)生和釋放，刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管生成[20]。這種STAT5A效應(yīng)可能參與了HAPC相關(guān)血管生成功能通路的激活。本研究暫未發(fā)現(xiàn)STAT5A基因與HAPC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，其原因可能是STAT5的高度活化雖然主要導(dǎo)致紅細(xì)胞生成，但這種效應(yīng)的持續(xù)性或較為短暫。RUNDC3B基因編碼Rap2互作蛋白-9，其功能尚不明確，在正常的睪丸、腎上腺和大腦中呈高水平表達(dá)，而在正常乳腺中則呈低水平表達(dá)[21]。RUNDC3B基因的表達(dá)水平與孕激素的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)[22]，乳腺惡性上皮細(xì)胞RUNDC3B的活化隨侵襲性表型的進(jìn)展而增加[21]，這種過(guò)表達(dá)與乳腺惡性腫瘤預(yù)后不良相關(guān)。此外，RUNDC3B基因位于ABCB1基因的擴(kuò)增子區(qū)域，由ABCB1基因的互補(bǔ)DNA鏈轉(zhuǎn)錄而來(lái)，可能干擾ABCB1基因啟動(dòng)子調(diào)控的交替調(diào)控[23]。本研究發(fā)現(xiàn)的RUNDC3B基因SNPs與HAPC患病風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)，這可能是由于RUNDC3B基因恰好位于ABCB1基因的特殊位置，ABCB1基因削弱或抵消了前者促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用。

綜上所述，STAT3基因rs2293152位點(diǎn)可能作為保護(hù)因素，參與西藏世居高原人群HAPC發(fā)生過(guò)程，對(duì)HAPC的發(fā)展起到一定的遏制性作用。