李美琦綜述 駱倩倩審校

(南通大學(xué)特種醫(yī)學(xué)研究院低氧生物醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226019)

高原紅細(xì)胞增多是一種典型的慢性高原病，特點(diǎn)是紅細(xì)胞的大量生成及累積。鐵是紅細(xì)胞合成的重要原料，在正常情況下機(jī)體的鐵穩(wěn)態(tài)處于平衡狀態(tài)，但是在高原低氧環(huán)境下，鐵代謝發(fā)生明顯改變，機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)被打破并顯著影響紅細(xì)胞生成。本文圍繞低氧對(duì)機(jī)體鐵代謝的影響和高原低氧下機(jī)體鐵代謝的變化對(duì)紅細(xì)胞生成的影響進(jìn)行綜述。

1.高原低氧的適應(yīng)

缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者，也是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧環(huán)境的核心調(diào)節(jié)因子[1]。HIF是由受氧濃度誘導(dǎo)型表達(dá)的HIF-α亞基和組成型表達(dá)的HIF-β亞基組成的異源二聚體[2]，其中HIF-α有3個(gè)亞型(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)并分別由三個(gè)獨(dú)立的基因(HIF1A、EPAS1和HIF3A)編碼，HIF-β只有一種亞型。HIF-1α和HIF-2α以不同的方式與DNA結(jié)合，參與紅細(xì)胞生成的途徑的調(diào)控。通常認(rèn)為HIF-1α參與急性缺氧反應(yīng)而HIF-2α參與慢性缺氧反應(yīng)。目前關(guān)于HIF-3α的研究較少。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶(Prolyl hydroxylase，PHD)可以將氧氣、亞鐵和α-酮戊二酸作為底物，在氧依賴性降解域內(nèi)對(duì)HIF-α亞基進(jìn)行羥基化，羥基化的HIF-1α被pVHL識(shí)別，隨后募集E3泛素連接酶對(duì)其復(fù)合物進(jìn)行泛素化[3]，最后經(jīng)過蛋白酶體降解途徑被降解[4]。在低氧環(huán)境中，PHD處于抑制狀態(tài)，HIF-α可與細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白90結(jié)合使HIF-α穩(wěn)定，經(jīng)過HIF-α的C端的核定位信號(hào)的協(xié)助，使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-β形成異源二聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)功能。當(dāng)HIF結(jié)合到靶基因低氧反應(yīng)原件(HRE)上時(shí)，募集轉(zhuǎn)錄共激活因子CBP/p300來激活相關(guān)靶基因[包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)[5]]刺激骨髓生成新的紅細(xì)胞；增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)血管生成增加供血；增加無氧酵解過程中相關(guān)基因(PDK1、LDHA、GLUT1等)的表達(dá)，以對(duì)低氧作出適應(yīng)性反應(yīng)[6]。PHD具有3個(gè)亞型，其中PHD1主要位于細(xì)胞漿，PHD2主要位于細(xì)胞核，而PHD3在胞漿和胞核都存在。PHD作為HIF-α氧傳感器的調(diào)節(jié)劑，其活性也受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的控制。

雖然高海拔低氧環(huán)境容易導(dǎo)致高原病的發(fā)生，然而一些久居高原人群卻對(duì)高原環(huán)境表現(xiàn)出了獨(dú)特的適應(yīng)性。研究表明藏族人群特有的HIF-2α(又稱EPAS1)[7]、PHD2(又稱EGLN1)[8]和血紅素加氧酶2(HMOX2)[9]基因均有不同于漢族人群的突變，正是這些遺傳基因的突變阻止了藏族人血紅蛋白濃度的過度升高，降低了各種高原性疾病發(fā)生的可能性。但無論是EPAS1、EGLN1，還是HMOX2，都是通過降低藏族人血液中的血紅蛋白的量來使藏族人適應(yīng)低氧環(huán)境。而急進(jìn)高原者或移居者在這些基因沒有發(fā)生突變的情況下是如何適應(yīng)高原低氧環(huán)境的具體機(jī)制尚不清楚。

2.高原低氧對(duì)鐵代謝的影響

在高原低氧暴露時(shí)，機(jī)體正是通過調(diào)節(jié)或影響鐵調(diào)素(Hepcidin，Hepc)、鐵輸出蛋白(Ferroportin，F(xiàn)pn)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，Tf)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor，TfR)、鐵蛋白(Ferritin，F(xiàn)t)、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1 (Divalent metal transporter l，DMT1)這些鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體鐵代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，從而保證高原暴露情況下新的血紅蛋白生成對(duì)鐵的需求。

2.1 高原低氧對(duì)Hepc的影響

Hepc是由肝臟合成并分泌的富含半胱氨酸的25個(gè)氨基酸的抗菌多肽，以抑制鐵超載或炎癥來調(diào)節(jié)全身鐵穩(wěn)態(tài)。它可以影響腸道鐵吸收、巨噬細(xì)胞鐵釋放以及肝臟鐵存儲(chǔ)。Hepc的主要作用方式是通過結(jié)合其受體蛋白——膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Fpn來實(shí)現(xiàn)的。Hepc與細(xì)胞膜上的Fpn結(jié)合可引起Fpn內(nèi)化，形成內(nèi)吞小體后與溶酶體融合并在其中被降解[10]。在巨噬細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中Fpn的表達(dá)量很豐富，因此在這些細(xì)胞中Hepc的調(diào)節(jié)作用最為顯著。Hepc正是通過調(diào)節(jié)這三個(gè)組織部位的Fpn的量來調(diào)節(jié)機(jī)體中的鐵穩(wěn)態(tài)。機(jī)體在發(fā)生應(yīng)激紅細(xì)胞生成和缺氧、生長(zhǎng)、妊娠等條件下，通過抑制Hepc的生成，促進(jìn)外周鐵增加以滿足機(jī)體對(duì)鐵的需求[11]。低氧下的相關(guān)研究表明，HIF-1α可以通過直接與Hepc的啟動(dòng)子結(jié)合來抑制Hepc的表達(dá)[12]。后來又有研究指出，在缺氧條件下由于紅細(xì)胞生成的增多引起紅鐵酮(EFRE)的表達(dá)增多，而EFRE可以抑制Hepc的產(chǎn)生，當(dāng)體內(nèi)鐵充足時(shí)，紅細(xì)胞的生成速度不受影響，紅細(xì)胞數(shù)量增多，未成熟的紅細(xì)胞生成并分泌EFRE以抑制Hepc，使Fpn正常釋放儲(chǔ)存鐵，以供應(yīng)紅細(xì)胞的生成[13]。另外，HIF-2α也被證明可以通過促進(jìn)EPO的表達(dá)致紅細(xì)胞數(shù)增多來抑制Hepc的表達(dá)[14]。高海拔情況下，嚴(yán)重的能量不足也會(huì)抑制Hepc表達(dá)，但是在高原肺水腫患者中它是增加的[15]。

2.2 高原低氧對(duì)Fpn的影響

Fpn是一種含有12次跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，是目前已知唯一的膜結(jié)合鐵輸出蛋白，它的主要功能是負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的鐵從細(xì)胞內(nèi)輸出到細(xì)胞外。Fpn僅在幾種類型細(xì)胞中表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞[16]，并可將鐵釋放到血漿中，經(jīng)過轉(zhuǎn)鐵蛋白的運(yùn)輸，參與紅細(xì)胞的生成。脾臟巨噬細(xì)胞在從受損或衰老的紅細(xì)胞回收鐵的過程中起主要作用，并通過巨噬細(xì)胞膜表面上的Fpn將從血紅蛋白上回收的鐵輸出至血漿中供機(jī)體循環(huán)利用[17]。因此細(xì)胞表面上的Fpn數(shù)量直接決定了鐵的輸出量。高原低氧對(duì)Fpn的影響主要是通過Hepc間接產(chǎn)生的[18]。早前的一項(xiàng)研究表明HIF-2α可以調(diào)節(jié)Fpn mRNA的表達(dá)，但是最近的研究證實(shí)，在小腸中，F(xiàn)pn通過控制細(xì)胞鐵輸出調(diào)節(jié)鐵依賴PHD的活性，可以穩(wěn)定和激活HIF-2α[19]。

2.3 高原低氧對(duì)Tf及TfR的影響

Tf是鐵的運(yùn)載載體，在血漿中以三價(jià)鐵結(jié)合態(tài)和未結(jié)合態(tài)形式存在[20]，游離鐵一旦進(jìn)入血液就會(huì)與Tf結(jié)合，通過血液將鐵輸送到全身各處。到達(dá)需鐵的細(xì)胞后通過TfR介導(dǎo)攝入。TfR識(shí)別含鐵Tf后，發(fā)生網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞，形成內(nèi)吞小體，隨后通過內(nèi)吞小體膜上的DMT1將鐵釋放到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入胞內(nèi)的鐵可通過Fpn輸出細(xì)胞，多余的鐵則被存儲(chǔ)到鐵蛋白Ft-L上[21]。通過TfR吸收與Tf結(jié)合的鐵是大多數(shù)細(xì)胞中鐵的主要來源[22]。但是也有研究認(rèn)為，TfR還可介導(dǎo)Tf和H-鐵蛋白(Ft-H，一種鐵儲(chǔ)存蛋白)的攝取[23]。血清Tf在肝臟、脾臟、腎臟和樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有合成[24]。Tf的功能對(duì)于調(diào)節(jié)胚胎生長(zhǎng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、葡萄糖代謝和運(yùn)動(dòng)、增殖、分化至關(guān)重要。TfR的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)鐵水平的影響強(qiáng)烈：鐵缺乏時(shí)TfR的合成被激活，充足時(shí)則相反。因此，在大多數(shù)細(xì)胞中鐵的攝取水平通過調(diào)節(jié)TfR的表達(dá)實(shí)現(xiàn)[25]。有研究認(rèn)為，TfR2/HFE復(fù)合物被認(rèn)為可激活Hepcidin的轉(zhuǎn)錄[26]。同時(shí)，TfR2與促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)的復(fù)合物會(huì)使細(xì)胞表面的EPOR更加穩(wěn)定，而缺少TfR2會(huì)導(dǎo)致人類紅系祖細(xì)胞的終末分化延遲，且會(huì)增加紅系前體細(xì)胞的EPO敏感性[27]。另外，有研究認(rèn)為HIF可通過與TfR啟動(dòng)子中的特定低氧反應(yīng)元件結(jié)合誘導(dǎo)TfR基因轉(zhuǎn)錄。在Hep3B人肝癌細(xì)胞中，在1% O2或模擬缺氧下經(jīng)CoCl2處理，TfR mRNA增加了3倍[28]，顯示低氧可以誘導(dǎo)TfR基因的轉(zhuǎn)錄。

2.4 高原低氧對(duì)Ft的影響

Ft是在各組織細(xì)胞中廣泛存在的主要的鐵存儲(chǔ)蛋白，對(duì)鐵的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Ft基因在所有動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá)[29]，F(xiàn)t有兩種亞基類型，分別為H型和L型，即Ft-H和Ft-L。這兩個(gè)亞基的比例隨組織類型的不同而有很大差異[30]。組織鐵蛋白H亞基主要存在于心臟和腎臟中，L亞基主要存在于肝臟和脾臟中。Ft有助于正常的鐵流動(dòng)，當(dāng)機(jī)體鐵含量降低時(shí)，通過機(jī)體組織中核受體共激活因子4(NCOA4)對(duì)Ft的H亞基的識(shí)別，將Ft帶入溶酶體途徑降解，釋放其結(jié)合的鐵到胞漿再通過Fpn輸出細(xì)胞供機(jī)體利用[31]。當(dāng)暴露在高原低氧環(huán)境時(shí)，機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)Ft-L的表達(dá)顯著降低，以保證將其儲(chǔ)存的鐵用于造血。研究表明，低氧條件下機(jī)體產(chǎn)生ROS時(shí)Ft-H與Ft-L會(huì)聚集，在使用抗氧化劑后聚集作用減弱，這表明Ft-H與Ft-L的聚集可能是機(jī)體抵抗ROS的一種保護(hù)方式[32]。

2.5 高原低氧對(duì)DMT1的影響

DMT1是一種在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)的一種金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與機(jī)體內(nèi)二價(jià)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。食物中的鐵以兩種主要形式存在：血紅素鐵和非血紅素鐵，這兩種形式的鐵都可以被十二指腸吸收。但是大多數(shù)飲食中的非血紅素鐵是三價(jià)鐵配合物，因此食物中的非血紅素鐵在達(dá)到十二指腸后，首先用腸上皮細(xì)胞頂端膜上的十二指腸細(xì)胞色素b(DCYTB)將食物中的Fe3+還原為Fe2+后，再被膜上的DMT1轉(zhuǎn)入到腸上皮細(xì)胞內(nèi)[33]。DMT1屬于可溶性載體家族成員，由于DMT1的表達(dá)對(duì)維持全身和細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因此，全身和細(xì)胞鐵水平的變化均可直接或間接控制DMT1的表達(dá)。當(dāng)全身性鐵需求增加時(shí)，十二指腸中DMT1 mRNA和蛋白的表達(dá)增加，可促進(jìn)更多的鐵被吸收[34]。研究證實(shí)，低氧下DMT1表達(dá)增加的機(jī)制主要是通過HIF-1結(jié)合DMT1上的低氧反應(yīng)元件促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄增加蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3.高原低氧下鐵代謝改變對(duì)紅細(xì)胞生成的影響

低氧情況下機(jī)體對(duì)鐵的需求增加，且具有一定的海拔高度和暴露時(shí)間的依賴性[35]。多項(xiàng)研究認(rèn)為，機(jī)體在低氧下的鐵代謝相關(guān)蛋白發(fā)生明顯變化，如DMT1、TfR表達(dá)顯著升高，F(xiàn)t、Hepcidin表達(dá)顯著下降[36，37]。上述結(jié)果顯示，低氧下的鐵穩(wěn)態(tài)被打破后，鐵攝取及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)增加，儲(chǔ)存鐵釋放增加。對(duì)平原正常人群的研究發(fā)現(xiàn)，在剛進(jìn)入高原的早期，腸道內(nèi)的鐵吸收增加，之后紅細(xì)胞數(shù)量增加，在6個(gè)月之后，鐵的利用率依舊很高；對(duì)高原世居居民的研究發(fā)現(xiàn)，他們對(duì)鐵的利用率比平原正常人群高約30%，當(dāng)人們從高原轉(zhuǎn)移到平原后鐵的利用率明顯下降[38]。這提示鐵的利用率與紅細(xì)胞生成關(guān)系密切。研究二十五位健康的登山者的血清發(fā)現(xiàn)，高原暴露后的血清Hepc水平降低、十二指腸鐵吸收及運(yùn)輸上調(diào)[39]。另外，由于Tf、Fpn、DCYTB鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)等鐵代謝相關(guān)基因上均含有HRE，在低氧引起HIF增加后這些鐵代謝相關(guān)蛋白基因表達(dá)均有明顯增加[40]。

機(jī)體內(nèi)鐵的含量顯著影響紅細(xì)胞的生成，紅細(xì)胞在骨髓中分化時(shí)通過TfR介導(dǎo)的Tf的內(nèi)吞作用攝取鐵供應(yīng)血紅蛋白合成。紅細(xì)胞在生成期間TfR表達(dá)持續(xù)增加，但在網(wǎng)狀細(xì)胞釋放后被下調(diào)，在成熟紅細(xì)胞中則檢測(cè)不到TfR。Tf的缺失可抑制EPO生成，導(dǎo)致儲(chǔ)存器官中的鐵積累，這表明紅細(xì)胞發(fā)育成熟中需要TfR介導(dǎo)的鐵攝入，Tf與TfR在EPO生成中至關(guān)重要。

有研究表明，當(dāng)給予HIF穩(wěn)定劑二甲基草酰甘氨酸(DMOG)時(shí)，能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變[41]，而在低氧后巨噬細(xì)胞也表現(xiàn)出相同的變化[42]。雖然眾所周知M1型被認(rèn)為是促炎型巨噬細(xì)胞，M2型被認(rèn)為是抑炎型巨噬細(xì)胞。但是研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)HMOX1的表達(dá)并上調(diào)Fpn，使血紅素的氧化降解加快，促進(jìn)衰老紅細(xì)胞的清除并促使鐵有效的被循環(huán)利用[43]。提示，低氧可能通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變而對(duì)鐵的回收再循環(huán)利用產(chǎn)生重要影響。近期還有研究表明，低氧刺激致HIF被激活，有利于巨噬細(xì)胞對(duì)亞馬遜利什曼原蟲的吞噬[44]，隨后另一項(xiàng)研究也得到了相同的結(jié)論[45]。然而也有研究表明，在高原低氧條件下，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力是下降的[46]。這其中的差異可能源自不同的低氧條件。低氧暴露是否影響了巨噬細(xì)胞的活性或數(shù)量目前尚不清楚。

近年來研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞死亡方式—鐵死亡，這是一種以大量鐵離子累積為特點(diǎn)的新型細(xì)胞死亡方式，在鐵和酶的催化下，細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵依賴性死亡[47]。有研究表明在低氧環(huán)境下人體活性氧族(ROS)、丙二醛(MDA)水平增加，與鐵死亡相關(guān)的蛋白變化明顯[48]。另外研究還發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，肺泡巨噬細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)總量明顯上升，且巨噬細(xì)胞由M1向M2型轉(zhuǎn)變[49]；骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在給予去鐵胺(DFO)螯合鐵后，HIF-1α/環(huán)氧化酶2(COX-2)通路被激活，巨噬細(xì)胞也會(huì)由M1型向M2型轉(zhuǎn)變[50]。由骨髓巨噬細(xì)胞定向誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞后，在低氧條件下其SOD1、SOD2和HMOX1及谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)水平均呈明顯下降趨勢(shì)，復(fù)氧時(shí)有所回升。這提示低氧會(huì)引起M2型骨髓巨噬細(xì)胞的抗氧化能力降低，組織巨噬細(xì)胞在處理回收鐵后，由于胞內(nèi)增加的鐵含量和抗氧化力的降低，極易誘發(fā)鐵依賴性的鐵死亡。但高原低氧暴露后組織巨噬細(xì)胞是否發(fā)生鐵死亡及其對(duì)紅細(xì)胞的生成及清除能力的影響還有待進(jìn)一步深入探究。雖然目前對(duì)于高原低氧是如何致巨噬細(xì)胞功能改變并引起鐵代謝改變的機(jī)制尚不清楚，但可以明確的是，在高原低氧狀態(tài)時(shí)巨噬細(xì)胞功能發(fā)生了改變，這些改變可影響鐵代謝的穩(wěn)態(tài)并影響紅細(xì)胞的生成。

4.展望

機(jī)體通過復(fù)雜而又精確的機(jī)制維持鐵穩(wěn)態(tài)，以滿足紅細(xì)胞生成以及其他細(xì)胞功能對(duì)鐵的需求。高原低氧環(huán)境在多個(gè)層面和分子水平影響機(jī)體鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)及鐵的吸收、存儲(chǔ)與循環(huán)再利用的過程。高原低氧暴露可引起紅細(xì)胞數(shù)的顯著增加，導(dǎo)致高原紅細(xì)胞增多癥。鐵代謝紊亂是否是低氧條件下直接引起紅細(xì)胞增多癥發(fā)生發(fā)展的原因？我們近期關(guān)于高原低氧暴露對(duì)脾臟功能的研究也揭示低氧暴露可顯著抑制脾臟紅髓巨噬細(xì)胞的數(shù)量和吞噬能力，是否是高原低氧暴露后巨噬細(xì)胞的鐵過載影響了其數(shù)量及吞噬能力還需要通過進(jìn)一步的研究去證實(shí)。