張欣雨 王智宇 趙文元 馬保錄 陶 濤

(1 青海省交通醫(yī)院泌尿外科，西寧市 810008，電子郵箱：mnwk5825@sohu.com；2 鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南省鄭州市 450000；3 青海大學附屬醫(yī)院泌尿外科，西寧市 810008)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，臨床上常采用手術聯(lián)合經(jīng)膀胱灌注進行治療，雖然該方法的療效較好，但是腫瘤復發(fā)仍然是膀胱癌治療中亟待解決的一大難題[1-4]。姜黃素是從姜黃科植物中提取得到的有效成分，在莪術、姜黃等中藥材的根莖中含量較多。有研究表明，姜黃素對宮頸癌、卵巢癌及淋巴癌細胞的增殖具有明顯的抑制效果，是較為廣譜的腫瘤抑制化合物，且毒性及副作用很小[5-8]。但目前有關姜黃素對膀胱癌的治療作用及其作用機制的研究相對較少。有學者指出，機體微環(huán)境氧化應激反應亢進和抗氧化酶的活力受損在膀胱癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，此外，炎癥反應也參與了膀胱癌的發(fā)展過程[9-13]。本研究分析姜黃素對膀胱癌模型大鼠的干預效果，以及對膀胱癌大鼠機體炎癥反應、氧化應激反應的影響，為膀胱癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取100只健康雄性5周齡SD大鼠(購自中科院動物研究所，許可號：2019A210)，體重140～160 g，實驗前于21℃～24℃飼養(yǎng)條件下，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑和儀器 N-丁基-N-(4-羥丁基)亞硝基胺[N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine,BBN]購自日本化成工業(yè)株式會社(批號：20190203)，姜黃素購自西安正東生物科技有限公司(純度>98%，批號：458-37-7)，白細胞介素1β(interleukin,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號：20190217)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)ELISA試劑盒(批號：20190621)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)ELISA試劑盒(批號：20201202)均購自南京森貝伽生物科技有限公司，自由基一氧化氮(批號：20181208)、丙二醛(批號：20200211)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號：20191211)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒(批號：20200209)均購自日本同仁化學公司。酶標儀(SuPerMax 3000FL)購自上海閃譜生物科技有限公司，電動移液器購自北京金時速儀器設備有限公司，高速離心機(型號：MiniSpin)購自浙江納德科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及建模方法：按照隨機數(shù)字表法，將100只雄性SD大鼠分為對照組、模型組、60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組，各25只。使用200 mg/0.5 mL BBN(按乙醇：水為1 ∶4的比例，配制成BBN混懸液)，以200 ms/0.5 mL的速度對模型組和姜黃素組大鼠進行灌胃，對照組大鼠給予等量的生理鹽水進行灌胃，2次/周，每次時間間隔為2～3 d，連續(xù)灌胃8周。8周后通過CT掃描觀察大鼠膀胱組織，正常膀胱組織黏膜光滑，未見腫塊，若組織黏膜出現(xiàn)異常，并有新生腫塊證明膀胱癌建模成功。本實驗中模型組和姜黃素組大鼠均建模成功。

1.3.2 干預方法：從第一次BBN開始灌胃的前7 d開始，給予60 mg/kg姜黃素組和120 mg/kg姜黃素組大鼠相應劑量的200 μL姜黃素進行灌胃干預，1次/d，連續(xù)干預8周，之后給予200 μL生理鹽水進行灌胃，1次/d，持續(xù)操作8個月；對照組及模型組大鼠則在相同時間段給予200 μL生理鹽水進行灌胃，1次/d，持續(xù)操作8個月。各組中由于灌胃引發(fā)內(nèi)臟受損或死亡的大鼠予以剔除，最終納入對照組20只、模型組25只、60 mg/kg姜黃素組24只、120 mg/kg姜黃素組24只。

1.3.3 標本采集：灌胃結束后，收集各組大鼠股靜脈血1～2 mL，室溫條件下靜置 25 min，隨后在4℃下以2 000 r/min離心15 min，取上清分裝于0.5 mL的EP管中，并儲存于-20℃的冰箱中備用。

1.3.4 炎癥、氧化應激指標的檢測：采用ELISA法檢測血清炎癥指標IL-1β、CRP以及TGF-β1水平，采用硝酸還原酶法檢測血清一氧化氮水平，采用硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛水平，采用水溶性四唑鹽法檢測血清SOD水平，采用Fe3+還原法檢測血清T-AOC水平，所有操作步驟均嚴格按照試劑盒的操作說明進行。

1.3.5 大鼠膀胱組織的病理變化：股動脈采血后采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，剝離完整的大鼠膀胱，用10%的甲醛溶液固定膀胱組織后進行石蠟包埋，制作4 μm石蠟切片，常規(guī)進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察組織的病理變化，觀察上皮組織增厚現(xiàn)象、膀胱細胞的層次、細胞核的大小均勻情況等，并行病理檢測診斷膀胱癌的類型，包括浸潤性尿路上皮癌與非浸潤性膀胱尿路上皮癌。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠血清炎癥指標水平的比較 4組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1等炎癥指標水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其中，模型組、60 mg/kg姜黃素組大鼠的血清IL-1β、CRP和TGF-β1水平均高于對照組(均P<0.05)，而120 mg/kg姜黃素組大鼠的血清IL-1β、TGF-β1水平與對照組差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，但血清CRP水平高于對照組(P<0.05)；60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于模型組(均P<0.05)，且120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于60 mg/kg姜黃素組(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血清炎癥指標水平的比較(x±s)

2.2 4組大鼠血清氧化應激指標水平的比較 4組大鼠血清氧化應激指標水平比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。其中，模型組、60 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均高于對照組，血清SOD、T-AOC水平均低于對照組(均P<0.05)，而120 mg/kg姜黃素組大鼠血清丙二醛水平高于對照組、SOD水平低于對照組(均P<0.05)；60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于模型組，血清SOD和T-AOC水平均高于模型組，且120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于60 mg/kg姜黃素組，血清SOD、T-AOC水平均高于60 mg/kg姜黃素組(均P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清氧化應激指標水平的比較(x±s)

2.3 各組大鼠膀胱組織的病理變化情況 HE染色后，顯微鏡下可見對照組大鼠的膀胱組織正常(圖1A)，而模型組和不同劑量姜黃素組大鼠的膀胱組織出現(xiàn)程度不同的癌變現(xiàn)象，均能夠觀察到增厚的被覆移行上皮組織，并且膀胱細胞的層次變多，細胞核的大小出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象(圖1B、C、D)；但與模型組相比，60 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織的細胞層次變少(圖1C)，120 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織中部分細胞形態(tài)規(guī)則并且表現(xiàn)為不典型增生(圖1D)。

圖1 4組大鼠膀胱病理學改變(HE染色，×100)注：A、B、C、D分別表示對照組、模型組、60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組。

模型組、60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱癌病理類型比例比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中120 mg/kg姜黃素組非浸潤性膀胱尿路上皮癌的比例高于模型組，而浸潤性膀胱尿路上皮癌的比例低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠膀胱癌類型的比較[n(%)]

3 討 論

膀胱癌是全球發(fā)病率位居第10的癌癥，同時也是泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率排名第1的疾病[14]。據(jù)統(tǒng)計，相較于1990年，2017年全球膀胱癌的發(fā)病人數(shù)增長90%以上，死亡人數(shù)增長70%左右，60歲的老年人群發(fā)病率更高，隨著我國進入老齡化社會，膀胱癌的發(fā)病以及死亡人數(shù)均呈上升的趨勢[15]。膀胱癌的高發(fā)病率與環(huán)境和生產(chǎn)、生活習慣等息息相關，如何降低膀胱癌的發(fā)病率與復發(fā)率，已成為目前研究的熱點。本研究采用BBN灌胃建立膀胱癌大鼠模型，結果顯示模型組和不同劑量姜黃素組大鼠的膀胱組織均出現(xiàn)不同程度的癌變現(xiàn)象，表明建模成功。與模型組相比，60 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織的細胞層次變少，120 mg/kg姜黃素組大鼠膀胱組織中部分細胞形態(tài)規(guī)則，并且細胞表現(xiàn)不典型增生，表明姜黃素能夠抑制膀胱細胞的癌變過程，大劑量姜黃素能夠更為有效地減緩膀胱組織惡化的進程。此外，本研究結果顯示，120 mg/kg姜黃素組大鼠中非浸潤性膀胱尿路上皮癌的比例高于模型組，而浸潤性膀胱尿路上皮癌的比例低于模型組(P<0.05)，進一步表明較高濃度的姜黃素對浸潤性膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展具有抑制作用。

相關研究表明，氧化應激反應與膀胱癌的發(fā)展有關[16-18]。Gecit等[17]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者的血清T-AOC水平較健康者明顯降低，而血清一氧化氮及丙二醛水平較健康者明顯升高。呂夷松等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與浸潤性膀胱癌患者相比，非浸潤性膀胱癌患者血清T-AOC和SOD水平均明顯升高，丙二醛水平明顯降低。本研究結果顯示，模型組大鼠血清T-AOC及SOD水平均較對照組大鼠降低，而一氧化氮和丙二醛水平較對照組大鼠上升(P<0.05)，與上述研究結果相似。而經(jīng)姜黃素灌胃干預后，60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于模型組，血清SOD和T-AOC水平均高于模型組(均P<0.05)，表明姜黃素對膀胱癌發(fā)展的抑制作用可能與其抑制機體自由基產(chǎn)生、阻止機體脂質(zhì)過氧化物的堆積以及激發(fā)抗氧化酶的活性有關。此外，本研究中120 mg/kg姜黃素組大鼠血清一氧化氮、丙二醛水平均低于60 mg/kg姜黃素組，血清SOD、T-AOC水平均高于60 mg/kg姜黃素組，說明較高濃度的姜黃素更能有效地抑制膀胱癌大鼠機體自由基的產(chǎn)生，具有更好的抗氧化效果。

膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過程中會伴有不同程度的炎癥反應。有學者采用顯微鏡對膀胱癌及癌旁組織的病理現(xiàn)象進行觀察，發(fā)現(xiàn)由膀胱癌旁組織開始就已經(jīng)出現(xiàn)炎性細胞以及淋巴細胞的浸潤[19]。還有研究表明，炎癥基因(TP53、IL-6等)的多態(tài)性與膀胱癌之間存在相關性，表明膀胱癌的發(fā)生與炎癥反應關系密切[20]。李慶等[21]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者腫瘤組織中TGF-β1的表達水平與腫瘤臨床分期、病理組織分級和淋巴結轉移情況存在明顯的相關性。CRP作為促炎因子刺激肝臟時可產(chǎn)生急性時相蛋白，當機體發(fā)生感染、創(chuàng)傷或者腫瘤時其水平上升尤其明顯，Grimm等[22]發(fā)現(xiàn)，CRP水平越高，膀胱癌患者的預后越差，術后總生存時間越短。此外，IL-1β也是細胞內(nèi)重要的促炎因子[23]。本研究結果顯示，膀胱癌模型大鼠血清IL-1β、CRP、TGF-β1水平均高于對照組大鼠，而60 mg/kg姜黃素組、120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于模型組(均P<0.05)，這提示膀胱癌大鼠體內(nèi)炎癥反應水平升高，而姜黃素可降低膀胱癌大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平，姜黃素抑制膀胱癌模型大鼠的腫瘤發(fā)展可能與其對炎癥反應的抑制相關；同時，本研究結果顯示，120 mg/kg姜黃素組大鼠血清IL-1β、CRP及TGF-β1水平均低于60 mg/kg姜黃素組(均P<0.05)，說明較高濃度姜黃素對膀胱癌大鼠炎癥反應的抑制效果更佳。

綜上所述，姜黃素能夠抑制膀胱癌大鼠的組織病理學進展，可能與其抑制機體炎癥反應和氧化應激反應有關。然而，姜黃素對膀胱癌的治療效果及作用機制，還需要結合臨床試驗結果進一步驗證。