王晶，林澤棟，李艷，薛曉晶

（1.中檢科（北京）測試技術(shù)有限公司，北京 100123；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心，北京 100123）

0 引言

葉酸是人體營養(yǎng)代謝重要的輔助因子及前體物質(zhì)[1-2]，需通過飲食攝取[3]。葉酸缺乏可導(dǎo)致生理功能低下及某些疾病，尤其是孕婦存在新生兒神經(jīng)管畸形、早產(chǎn)等風(fēng)險[4-5]。嬰幼兒適量補充葉酸，對其神經(jīng)與腦細(xì)胞發(fā)育有良好的促進作用[6]。

葉酸測定方法有微生物法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、免疫親和層析法等[7-10]。微生物法是測定葉酸的主要方法和仲裁方法[11]。但微生物方法操作復(fù)雜，不適合高通量檢測[12]。為簡化操作，近年出現(xiàn)了相關(guān)試劑盒的研究[13-14]，但試劑盒方法也存在成本高，培養(yǎng)時間長等問題。楊小平[15]等人參考商品化試劑盒研究了EP管法測定葉酸含量，培養(yǎng)時間也需要40 h以上。因此，有必要建立一個高效準(zhǔn)確，操作簡便的檢測方法。

本文選擇微孔板培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀替代分光光度計測定葉酸結(jié)果。其準(zhǔn)確度高、可操作性強、重復(fù)性好，且較之其他方法用時短，與國標(biāo)方法檢測結(jié)果一致，適合高通量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳粉樣品，市售；葉酸質(zhì)控樣品，嬰兒配方乳粉（QC-IP-703），中國檢科院測試評價中心。菌種：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）（ATCC 7469）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

試劑：葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，（純度99.8%），上海安譜實驗科技股份有限公司；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、葉酸測定用培養(yǎng)基，北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

XS105電子天平、S220p H計，梅特勒-托利多公司；KQ-25Z超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；G180TW高壓滅菌鍋，中國致微公司；MIR-254-PC培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司；multiskan go酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；NU-437-600E生物安全柜，梅特勒-托利多公司；高結(jié)合培養(yǎng)板、TC處理培養(yǎng)板，美國Corning公司；BIOFIL TC處理培養(yǎng)板，廣州潔特生物過濾股份有限公司；耐思普通培養(yǎng)板、耐思TC處理培養(yǎng)板，無錫耐思生命科技股份有限公司；Cycler Seal Sealing Film，美國Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（20.0μg/mL）：精確稱取葉酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用氫氧化鈉乙醇溶液溶解，定容至1 000 mL。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（0.200μg/mL）：吸取1 m L葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用氫氧化鈉乙醇溶液稀釋，定容至100 m L。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.100 ng/mL，0.200 ng/mL）：吸取50μL葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，用蒸餾水稀釋，定容至100 m L，得到0.10 ng/m L高濃度標(biāo)準(zhǔn)品工作液；吸取100μL葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，用蒸餾水稀釋，定容至100 mL，得到0.20 ng/mL低濃度標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.2.2 樣品前處理

按照國標(biāo)GB 5009.211-2014[18]的直接提取法對樣品進行前處理。根據(jù)樣品中葉酸含量用水對樣品提取液進行適當(dāng)稀釋，使稀釋后樣品提取液中葉酸質(zhì)量濃度在0.2～0.6 ng/mL范圍內(nèi)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液的無菌處理

將配好的葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液、稀釋后的樣品提取液，于121℃高壓滅菌5 min，冷卻后備用。

1.2.4 制備接種液

將培養(yǎng)好的鼠李糖乳桿菌種子液振蕩混勻，吸取50μL菌懸液，無菌條件下接種到5 mL葉酸測定用培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6 h。振蕩混勻，制成接種液備用。

1.2.5 微孔板選擇

選取Costar 3590高結(jié)合培養(yǎng)板、Costar 3599 TC處理培養(yǎng)板、BIOFIL TC處理培養(yǎng)板、耐思普通培養(yǎng)板和耐思TC處理培養(yǎng)板。比較標(biāo)準(zhǔn)曲線各點A550的吸光度值和葉酸質(zhì)控樣品（QC-IP-703）的結(jié)果。

1.2.6 微孔板操作

將滅菌后的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品工作液、樣品提取液按照表1和表2加入到96孔微孔板中，每個濃度做3個平行。每個微孔再加入150μL含有0.3%菌懸液的葉酸測定用培養(yǎng)基?？瞻卓准尤霟o菌懸液的培養(yǎng)基。

表1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品工作液的配制

表2 樣品提取液的配制

1.2.7 培養(yǎng)及測定

將微孔板用無菌封口膜覆蓋后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h。培養(yǎng)后將微孔板充分混勻，用酶標(biāo)儀于550 nm測吸光度（OD）。

1.2.8 準(zhǔn)確性實驗和重復(fù)性實驗

在無葉酸的乳粉中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30，60，120μg/100g和240μg/100g的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)濃度做5個平行計算回收率結(jié)果。

隨機選取6個不同品牌的配方乳粉，每種乳粉進行6次重復(fù)性實驗，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 方法比對實驗

選取不同段、不同配方乳粉，分別用國標(biāo)方法和微孔板法測定其葉酸含量，并對結(jié)果進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微孔板比對結(jié)果

相同實驗條件下使用不同品牌型號的培養(yǎng)板，葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線各點A550的吸光度和葉酸質(zhì)控樣品的結(jié)果如表3和表4所示。結(jié)果顯示，5種不同的培養(yǎng)板對不同濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的吸光度值基本一致，葉酸質(zhì)控樣的檢測結(jié)果值均符合質(zhì)控值范圍。

表3 不同培養(yǎng)板標(biāo)曲吸光度值比較

表4 不同培養(yǎng)板葉酸質(zhì)控樣結(jié)果比較μg/100g

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葉酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。葉酸濃度在0.00～0.20 ng/m L，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2=0.9997。

圖1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 加標(biāo)回收實驗

在無葉酸的乳粉中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30，60，120μg/100 g和240μg/100 g的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)回收實驗，每個加標(biāo)濃度做5個平行計算回收率，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明4個加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，回收率范圍為96.5%～104%，平均回收率為101%±4.18%。

表5 加標(biāo)回收實驗結(jié)果μg/100g

2.4 重復(fù)性實驗

選取6種不同葉酸含量的配方乳粉，用微孔板法測定葉酸含量，每個樣品做6個平行，結(jié)果見表6。檢測結(jié)果的RSD在1.60%～4.27%之間。

表6 重復(fù)性實驗結(jié)果μg/100g

2.5 方法比對結(jié)果

選擇嬰兒配方乳粉、較大嬰兒及幼兒配方乳粉、乳蛋白深度水解配方粉、特殊醫(yī)學(xué)用途配方全營養(yǎng)粉和孕婦乳粉，標(biāo)記為樣品1-樣品6，分別用國標(biāo)法和微孔板法測定葉酸含量，每種樣品6個平行，結(jié)果見表7。對2種檢測方法的結(jié)果進行配對t檢驗，t=2.570，P=0.126，P＞0.05，2種方法無顯著差異。

表7 比對實驗結(jié)果μg/100g

（續(xù)表7）

3 結(jié)論

在國標(biāo)基礎(chǔ)上，用96孔微孔板代替玻璃試管進行微生物培養(yǎng)，既簡化操作又可防止玻璃試管上殘留的油脂和洗滌劑等外來因素對菌種的影響。96孔微孔板大多為聚苯乙烯材質(zhì)，實驗結(jié)果表明聚苯乙烯對本實驗的適應(yīng)性強，進口和國產(chǎn)不同規(guī)格的培養(yǎng)板差別不大。因本實驗不需要用到板蓋，考慮成本可以選擇不附帶板蓋的微孔板。此外，在微孔板中直接對樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)工作液進行梯度稀釋，無需先在離心管中稀釋、混勻再分裝到各孔，減少了操縱步驟，提高了結(jié)果穩(wěn)定性。按本方法的接菌方式和接菌量，22 h即可測定結(jié)果，縮短了樣品的培養(yǎng)時間。微孔板法重復(fù)性和準(zhǔn)確度較好，與國標(biāo)方法相比檢測結(jié)果無顯著性差異；與商品化試劑盒相比，成本更低。本方法適合大批量樣品檢測，適合在乳粉企業(yè)和檢測機構(gòu)推行。