李濤，周艷華，向俊,徐文泱,孫桂芳

(1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，食品安全監(jiān)測與預警湖南省重點實驗室，長沙 410111；2.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術(shù)學院，長沙 410004)

0 引言

牛奶是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)脂肪來源，而液態(tài)奶營養(yǎng)豐富極易腐敗變質(zhì)，將液態(tài)奶干燥工藝處理后得到乳粉，易于長期貯存，并營養(yǎng)強化了維生素礦物質(zhì)，如嬰幼兒配方奶粉、成人奶粉等。而隨著乳制品消費量逐年增加，人們特別關注乳制品安全，奶粉的主要消費群體為兒童和老人，抵抗力弱，更需要安全無藥物殘留的食品。喹諾酮是一類具有4-喹諾酮結(jié)構(gòu)，具有抗菌譜廣、活性強、價格低等特點，廣泛應用于人類和動物疾病的治療[1-2]。為獲取超額經(jīng)濟利益，部分養(yǎng)殖者為逃避監(jiān)管，變換喹諾酮使用類別，獸藥殘留的濫用超范圍使用仍然存在，從而導致動物源產(chǎn)品中殘留藥物殘留，低濃度的獸藥殘留也會產(chǎn)生毒性作用，如過敏、細菌耐藥，也可能對人體造成不良反應[3-5]。我國《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[6]規(guī)定：牛奶中恩諾沙星殘留量（與環(huán)丙沙星之和）≤100μg/kg，達氟沙星殘留量≤30μg/kg，氟甲喹殘留量≤50μg/kg，其他沙星類如氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星等均不得檢出。

目前，喹諾酮化合物檢測主要有HPLC法[7-8]、ELISA法[9]、LC-MS/MS法[10-11]等。液相色譜法對于少數(shù)幾種喹諾酮類化合物具有良好靈敏度；而酶聯(lián)免疫法前處理簡單，適用于基層檢測部門的初檢篩查。液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇好等優(yōu)點，是獸藥殘留定量定性分析的首選方法。GB/T 20366-2006[12]和GB/T 21312-2007[13]是現(xiàn)行國家標準中動物源性食品中喹諾酮類的國家推薦標準。GB/T 21312-2007采用HLB固相萃取柱凈化，前處理步驟繁雜，且沒有牛奶中有限量要求的達氟沙星項目，而GB/T20366-2006未對牛奶基質(zhì)進行驗證研究，不適用于奶粉中喹諾酮藥物殘留檢測。

試驗擬分散固相萃取法對對奶粉中16種喹諾酮化合物留凈化處理，超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測，并進行方法學驗證和基質(zhì)效應評價，建立了一種分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測奶粉中16種喹諾酮藥物殘留檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉，市售。

色譜純乙腈、甲酸，上海CNW公司；16種喹諾酮混合標準溶液（恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、達氟沙星、依諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、西諾沙星、氟甲喹、氟羅沙星、奧比沙星、麻保沙星）100μg/mL，天津邁迪嘉科技公司。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantis型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（配有電噴霧離子源），美國Thermo Fisher公司；BSA224s型電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TG16-WS型高速離心機，長沙市湘儀儀器有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司；945066型數(shù)顯型多管旋渦混合器，美國Talboys公司。

1.3 液相色譜條件及質(zhì)譜條件優(yōu)化

液相色譜條件為：A：0.1%（v/v）甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液，B：乙腈；流速0.25 mL/min；色譜柱溫30℃；進樣體積5μL，采用梯度洗脫模式。梯度洗脫程序見表1。在HESI離子源下，毛細管電壓3 500 V；霧化器溫度350℃，離子傳輸管溫度350℃；鞘氣壓4.58 L/min；輔助氣壓7.97 L/min，反吹氣1.5 L/min；取標準溶液直接進質(zhì)譜，通過SIM和SRM掃描，確定最優(yōu)質(zhì)譜條件。

表1 梯度洗脫程序

1.4 樣品前處理

精密稱取乳粉1.0 g，加入4 mL純水，振搖3 min后超聲15 min，加入16 mL 1%甲酸乙腈，振蕩15 min，離心，取4.0 mL上清液，加入分散固相萃取劑，振蕩10 min后離心，上清液氮吹至近干，10%乙腈水溶液定容至1.0 m L，過0.22μm有機濾膜，供超高效液相質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 方法學驗證

取空白乳粉，配制2.0～100 ng/m L基質(zhì)線性系列溶液，上機測定，繪制基質(zhì)標準曲線。在空白乳粉添加低濃度混合標準溶液，按最優(yōu)的前處理工藝處理后測定，S/N≥3的濃度為檢出限（LOD），S/N≥10的濃度為定量限（LOQ）。分別在空白乳粉中加入16種喹諾酮類混合標準溶液，加標后樣品濃度分別為2.0，4.0，20.0μg/kg(n=6)。測定16種喹諾酮藥物殘留的含量，計算回收率和相對標準偏差值。

1.6 基質(zhì)效應評價

取空白乳粉，配制基質(zhì)標準系列溶液，同時配制相同濃度的溶劑標準系列溶液，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測定后得基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線。依據(jù)ME=(基質(zhì)標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率)×100評價16種喹諾酮化合物的基質(zhì)效應[14]。

1.7 樣品檢測

取20批次乳粉，用所建立的檢測方法檢測樣品中16種喹諾酮類化合物，判定樣品中是否存在喹諾酮藥物殘留。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過標準物質(zhì)的CAS號查詢喹諾酮化合物分子量，通過SIM掃描，16種喹諾酮均在正離子模式下電離響應度最高，通過SRM掃描，得到喹諾酮質(zhì)譜參數(shù)，以信號強度最高的離子為定量離子，信號強度較強的離子為定性離子，16種喹諾酮類質(zhì)譜參數(shù)見表2。與高分辨質(zhì)譜相比較[15]，因其特殊的檢測器，高分辨質(zhì)譜在質(zhì)量精度和快速定性篩查具有較大優(yōu)勢，而三重四極桿質(zhì)譜在多化合物的高通量定量檢測具有較大優(yōu)勢，多反應離子監(jiān)測，一個母離子選一個子離子，在最優(yōu)碰撞電壓下，母離子碰撞產(chǎn)生的子離子中只選一個離子，兩次都選單離子，而高分辨質(zhì)譜是母離子碰撞產(chǎn)生多個子離子，因此三重四極桿質(zhì)譜噪音干擾排除的更多，靈敏度信噪比更高，穩(wěn)定性也更好。在最優(yōu)質(zhì)譜條件下，16種喹諾酮定量離子提取色譜圖見圖1，由圖1可知，16種喹諾酮化合物在12 min內(nèi)得到了有效分離。由于喹諾酮化合物種類較多，乙酸銨溶液可改善喹諾酮峰形，分離度更好，低濃度甲酸可為喹諾酮化合物電離時提供質(zhì)子，使其響應度和靈敏度更好。

圖1 喹諾酮類混合標準溶液定量離子色譜圖

表2 16喹諾酮類化合物的質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 凈化劑優(yōu)化

本研究比較了C18吸附劑、PSA吸附劑、NH2吸附劑、HLB吸附劑4種吸附劑對喹諾酮凈化效果。通過前處理步驟獲得含有16種喹諾酮藥物殘留的提取液，4 m L提取液分別加入200 mg吸附劑，振蕩離心過膜后測定目標化合物，計算回收率，回收率見圖2。結(jié)果表明，經(jīng)C18吸附劑和PSA吸附劑凈化后的回收率最高，16種喹諾酮回收率均高于70%，經(jīng)HLB吸附劑處理后，氧氟沙星和達氟沙星回收率較低，經(jīng)NH2吸附劑處理后，9種喹諾酮類回收率低于60%。NH2是由硅膠鍵合氨丙基，兼具極性吸附作用和弱陰離子交換作用，可通過弱陰離子交換（水溶液）或極性吸附（非極性有機溶液）達到保留作用。HLB吸附劑是一類用于酸性、中性和堿性化合物的通用型吸附劑，對極性化合物具有較強的保留能力。PSA吸附劑是一類藥物殘留分析前處理中分散固相萃取的常用凈化劑，PSA可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，可以有效去除脂肪酸,有機酸,和一些極性色素及糖，C18吸附劑，具有疏水作用，對非極性的組分有吸附作用，主要用于反相萃取，適合于非極性到中等極性的化合物。奶粉基質(zhì)復雜，含有蛋白質(zhì)、脂肪、金屬離子等，為確保凈化效果，本研究擬選擇C18吸附劑和PSA吸附劑進行凈化處理。

圖2 不同吸附劑對喹諾酮回收率的影響

2.3 凈化劑組合的優(yōu)化

單一凈化劑難以獲得多藥物殘留較為滿意的凈化效果，本研究在單一吸附劑的基礎上，選取了凈化效果較好的C18吸附劑和PSA吸附劑，對C18吸附劑和PSA吸附劑組合的用量進行了優(yōu)化。4 mL提取液分別加入吸附劑組合分別為100 mg C18+50、200 mg C18+100 mg PSA、300 mg C18+150 mg PSA，振蕩離心過膜后測定目標化合物，計算回收率，回收率結(jié)果見圖3。不同吸附劑用量對喹諾酮化合物回收率的也具有較大影響，當添加量為C18吸附劑用量為200 mg，PSA用量為100 mg時，各類化合物的回收率最高，當C18吸附劑用量為300 mg時，目標化合物的回收率反而降低，說明當吸附劑用量較高時，會對目標化合物產(chǎn)生吸附，從而降低了目標化合物的回收率，當吸附劑組合用量較低時，凈化不完全及凈化效果不好也會影響到目標化合物的回收率。

圖3 不同吸附劑用量對喹諾酮回收率的影響

2.4 線性關系、檢出限和定量限結(jié)果分析

由表3可知，16種喹諾酮濃度為2.0～100.0 ng/mL范圍內(nèi)，線性關系良好（R2≥0.997），檢出限（LOD）范圍為0.03～0.4μg/kg，定量限范圍（LOQ）為0.1～1.5 μg/kg，此方法所得大部分喹諾酮化合物的檢出限和定量限優(yōu)于GB/T 20366-2006和GB/T 21312-2007。不同喹諾酮化合物的分子量和結(jié)構(gòu)不同，在同一條件下的響應度和信噪比不同，因此檢出限和定量限也不同。

表3 喹諾酮化合物的標準曲線方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 準確度和精密度結(jié)果分析

由表4可知，當喹諾酮加標濃度為2.0μg/kg時，回收率范圍為78.7%～103.9%，相對標準偏差RSD為1.4%～3.9%；當喹諾酮加標濃度為4.0μg/kg時，回收率范圍為78.1%～105.3%，相對標準偏差RSD為0.9%～8.8%；當喹諾酮加標濃度為20.0μg/kg時，回收率為78.4%～100.2%，相對標準偏差RSD為1.4%～8.4%。3個濃度條件下加標回收率和精密度良好，回收率符合GB/T 27404-2008中當加標濃度＜0.1 mg/kg時，回收率范圍為60%～120%。結(jié)果表明本研究所建立的方法滿足奶粉中16種喹諾酮化合物的測定。

表4 喹諾酮化合物的回收率和精密度

2.6 基質(zhì)效應評價

由圖4可知，除依諾沙星和西諾沙星表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，其他14種喹諾酮的基質(zhì)效應在83.6%～119%范圍內(nèi)，基質(zhì)效應不明顯。因液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的離子源結(jié)構(gòu)特點，均出現(xiàn)基質(zhì)效應，通常會對目標化合物的靈敏度、準確度和重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響?；|(zhì)效應是一種評價檢驗方法的有效手段。通常采用改變凈化手段、增加同位素內(nèi)標及基質(zhì)標準曲線來降低基質(zhì)效應，內(nèi)標價格昂貴，且測定多種化合物需要添加多種內(nèi)標，會大大提高檢驗成本。本研究采用分散固相萃取法凈化了奶粉中的蛋白質(zhì)脂肪金屬元素等，并通過基質(zhì)標曲降低基質(zhì)效應。結(jié)果表明此研究方法中大部分喹諾酮類化合物基質(zhì)效應不明顯，保證檢驗結(jié)果準確性。

圖4 16種喹諾酮化合物的基質(zhì)效應

2.7 方法運用

從市場購買兒童奶粉、成人奶粉和老年奶粉、運用所建立的快速檢測方法進行檢測，樣品中均未檢出上述16種喹諾酮類化合物，且質(zhì)控樣品加標回收率符合GB/T 27404-2008要求，表明結(jié)果準確可靠。說明乳粉中喹諾酮化合物殘留風險較小，下一步將增加樣品量進行檢測。

3 結(jié)論

本文建立了快速檢測乳粉中16種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。采用液液萃取法提取樣品，分散固相萃取法凈化樣品，并對檢出限、定量限、準確度等方法學指標進行了驗證，采用基質(zhì)效應評價了檢驗方法的可靠性。與相關國家標準相比，此研究驗證了乳粉中喹諾酮化合物的檢測方法，增加了所檢測喹諾酮化合物的數(shù)量，定量限優(yōu)于國家標準，采用分散固相萃取法凈化樣品，提高了檢驗效率，降低了成本，提高了檢測通量，且基質(zhì)效應不明顯。該方法作為批量快速檢測乳粉中16種喹諾酮類化合物定量檢測方法，具有簡單高效、靈敏度高等優(yōu)點。為有效監(jiān)控乳粉中喹諾酮藥物殘留的提供了技術(shù)支持，保證了乳制品安全。