車建美，劉國(guó)紅，陳倩倩，劉 波

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州350003）

0 引言

【研究意義】龍眼焦腐病菌[Lasiodiplodiatheobromae（Pat.）Griffon&Maubl.]是龍眼采后病害的主要病原菌之一，采前以潛伏狀態(tài)存在，果實(shí)采收后，遇到合適的溫度和濕度，其菌絲穿透龍眼內(nèi)果皮，侵染果肉，破壞果肉細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，引起龍眼果實(shí)大量腐爛[1]，從而縮短龍眼果實(shí)的貨架期，給龍眼的采后儲(chǔ)運(yùn)造成巨大的病害威脅[2]。因此，探尋安全有效的龍眼焦腐病菌生物防治技術(shù)，可為解決龍眼采后儲(chǔ)運(yùn)問題奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】短短芽胞桿菌（Brevibacillus brevis）可形成抗逆性強(qiáng)的芽孢，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力，這些優(yōu)點(diǎn)為其應(yīng)用提供便利[3?5]。短短芽胞桿菌應(yīng)用廣泛，主要包括生物防治[6]、水質(zhì)凈化[7]和表達(dá)載體[8]等。從美國(guó)黃石國(guó)家公園土樣分離到一株短短芽胞桿菌菌株S1039，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)粗提物具有良好的抑菌活性，并且耐高溫、耐堿性物質(zhì)，對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，能夠抑制革蘭氏陰性菌及陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)[9]。從紫花苜蓿根際土中分離出的短短芽孢桿菌CY-42，其發(fā)酵液可以導(dǎo)致尖孢鐮刀菌菌絲及孢子生長(zhǎng)異常，出現(xiàn)菌絲扭曲、斷裂、破碎，孢子數(shù)量明顯減少等現(xiàn)象，對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相對(duì)防效為64.03%[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX為本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株生防菌株[11?12]，該菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和不同的真菌均具有較好的抑制效果[12]，對(duì)枇杷、龍眼等果實(shí)具有較好的保鮮效果[13?14]。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX可以抑制龍眼采后腐生細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，處理后的龍眼好果率明顯高于對(duì)照處理，并且可以減少脫粒率[13]。然而關(guān)于短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對(duì)龍眼焦腐病菌生物防治有待深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】分析短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對(duì)龍眼焦腐病菌的生長(zhǎng)和形態(tài)的影響，并研究其發(fā)酵液的生防效果及對(duì)龍眼果實(shí)防御酶活性的影響，以期為短短芽胞桿菌在龍眼焦腐病菌的采后生物防治應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

短短芽胞桿菌（Brevibacillus brevis）FJAT-0809-GLX和龍眼焦腐病菌[Lasiodiplodia theobromae（Pat.）Griffon&Maubl.]FJAT-3586由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。細(xì)菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基。龍眼焦腐病菌FJAT-3586培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。

1.2 離體條件下對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響

1.2.1 發(fā)酵上清液和菌體對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響挑取短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX單菌落于NA液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min?1培養(yǎng)12 h后，按1%接種量接入NA液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r·m in?1培養(yǎng)48 h后，13 000 r·m in?1離心2m in，取上清液備用。采用無(wú)菌水將菌體含量調(diào)至1×106個(gè)·m L?1。龍眼焦腐病病原菌FJAT-3586于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，取5 m L無(wú)菌水輕輕沖洗病原菌，制備病原菌孢子懸浮液（1×106個(gè)·m L?1）。取2m L龍眼焦腐病菌孢子懸浮液與20 m L PDA培養(yǎng)基混勻涂板，待其凝固后，采用打孔器打孔，孔徑為6mm，分別向不同孔中加入50μL拮抗菌菌體、發(fā)酵上清液和無(wú)菌水，30℃培養(yǎng)48 h后，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響分別取培養(yǎng)2、8、16、24、32、48、72 h的短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵液，13 000 r·m in?1離心2m in，取上清液進(jìn)行抑菌圈測(cè)定，測(cè)定方法同上，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 不同添加量發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響分別添加1、5、10、20、50 m L的短短芽胞桿 菌FJAT-0809-GLX發(fā) 酵 上 清 液于200 m L PDA培養(yǎng)基中，制備平板，取6mm龍眼焦腐病菌菌餅于該平板上，以等量的無(wú)菌水為對(duì)照，28℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌餅直徑并計(jì)算抑菌率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

式中，Φ對(duì)照為對(duì)照處理的菌落直徑，Φ處理為不同處理的菌落直徑，Φ菌餅為菌餅直徑。

1.2.4 對(duì)龍眼焦腐病菌菌絲形態(tài)影響的觀察將活化的龍眼焦腐病菌FJAT-3586在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，取6 mm菌餅置于PDA平板中央，在距離菌餅3 cm左右劃線短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX，并以無(wú)菌水作為對(duì)照，30℃培養(yǎng)4 d。挑取少量靠近短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理的菌絲于載玻片上，滴加少量無(wú)菌水，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡觀察。

1.3 離體果實(shí)接種的防治效果

將短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液用NB培養(yǎng)液稀釋20倍，備用；焦腐病菌FJAT-3586孢子液用無(wú)菌水稀釋至1×106個(gè)·m L?1。用蘸有75%酒精的酒精棉輕輕擦拭龍眼表面，晾干。將龍眼果實(shí)用短短芽胞桿菌發(fā)酵上清液浸泡30 s，晾干后再采用病原菌浸泡30 s。對(duì)照采用無(wú)菌水浸泡30 s，再采用病原菌浸泡30 s。每個(gè)處理30個(gè)，室溫放置3 d，統(tǒng)計(jì)龍眼果實(shí)的好果數(shù)量，計(jì)算好果率[好果率/%=（好果數(shù)量/全部數(shù)量）×100]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 對(duì)果皮防御酶活性的影響

取以上不同處理龍眼果皮組織1 g，加入10m L 0.05 mol·L?1磷酸緩沖液，研磨后于3 000 r·m in?1離心10 m in，取上清，用5 m L磷酸緩沖液提取沉淀2次，合并上清液定容至25m L作為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩⒄胀蹀钡萚15]的方法進(jìn)行SOD和CAT活性測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用M icrosoft Excel2010和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響

2.1.1 發(fā)酵上清液和菌體對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液和菌體對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)影響不同。如圖1所示，發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑為15.77mm；菌體具有微弱的抑制效果，抑菌圈直徑為3.84 mm；對(duì)照無(wú)菌水則無(wú)抑菌效果。

圖1 發(fā)酵上清液和菌體對(duì)龍眼焦腐病菌的抑菌圈Fig.1 L. theobrom ae inhibition zone shown on m edium by ferm entation supernatant or bacteria cells

2.1.2 不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響將不同培養(yǎng)時(shí)間的短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌測(cè)定，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)（圖2）。培養(yǎng)2 h和8 h的發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，培養(yǎng)16 h、48 h和72 h的抑菌圈直徑逐漸增大，分別為9.34、13.18、14.93 mm。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌的抑菌圈Fig. 2 L. theobromae inhibition zonesonmedium treated w ith supernatantsof varied fermentation time

2.1.3 不同添加量發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)基中添加不同量短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的影響有所不同（圖3）。添加1 m L的發(fā)酵上清液對(duì)該病原菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。隨著添加量的增多，抑制效果逐漸增強(qiáng)。添加5m L和10m L發(fā)酵上清液的抑菌率分別為28.30%和59.54%，添加50m L時(shí)，抑菌率可達(dá)74.17%。

圖3 不同添加量上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的抑制效果Fig.3 Inhibition of fermentation supernatant in varied dosages on grow th of L. theobromae

2.1.4 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對(duì)龍眼焦腐病菌菌絲形態(tài)的影響短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對(duì)龍眼焦腐病菌菌絲生長(zhǎng)形態(tài)具有一定的影響。對(duì)照組菌絲細(xì)長(zhǎng)，頂端無(wú)膨大，分叉少；處理組菌絲較粗，顏色較對(duì)照組略微加深，頂端膨大明顯（圖4）。

圖4 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對(duì)龍眼焦腐病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.4 L. theobromae m ycelial grow th on medium w ith B. brevis FJAT-0809-GLX

2.2 離體果實(shí)接種的防治效果

不同處理后龍眼果實(shí)好果率有所不同。將龍眼果實(shí)用發(fā)酵上清液浸泡后，再采用病原菌浸泡，其好果率為68.33%，明顯高于采用病原菌浸泡龍眼果實(shí)的好果率（圖5）。果實(shí)的外觀也明顯不同，病原菌浸泡后，果實(shí)表面會(huì)長(zhǎng)出病原菌菌絲，隨后果實(shí)出現(xiàn)水漬，直至全部腐爛。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后的果實(shí)表面菌絲生長(zhǎng)較少，腐爛果實(shí)數(shù)量也較少。

圖5 不同處理龍眼果實(shí)好果率Fig. 5 Ratesof healthy longan fruit under various treatments

2.3 對(duì)果皮防御酶活性的影響

不同處理龍眼果皮防御酶SOD和CAT活性有所不同（圖6）。病原菌處理的龍眼果皮SOD和CAT活性分別為71.09、31.65 U·g?1·min?1。生防菌處理后再用病原菌處理，果皮SOD和CAT活性均升高，顯著高于病原菌處理的SOD和CAT活性（P＜0.05），分別為139.43、54.54U·g?1·min?1。

圖6 不同處理對(duì)龍眼果皮SOD和CAT酶活性的影響Fig.6 Effect of various treatm ents on SOD and CAT activities in longan fruits

3 討論與結(jié)論

短短芽胞桿菌對(duì)香蕉炭疽病[16]、草莓灰霉病[17]和蓮霧黑腐病[18]等不同病害具有較好的抑制作用，近幾年來越來越多地應(yīng)用于植物病害的生物防治。付崗等[16]研究結(jié)果表明短短芽胞桿菌對(duì)香蕉炭疽病的防效為50.06%~65.74%。短短芽胞桿菌QGJ-6對(duì)番茄青枯病的生防效果達(dá)到82.4%[19]。本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后的龍眼果實(shí)好果率明顯高于病原菌單獨(dú)處理的好果率，可達(dá)68.33%，說明其對(duì)龍眼焦腐病菌具有較好的抑制作用，從而擴(kuò)大了短短芽胞桿菌在植物病害生物防治的應(yīng)用范圍。

短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液、菌體對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)的抑制效果不同，發(fā)酵上清液對(duì)龍眼焦腐病菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑為15.77 mm。這與張平等[20]的研究結(jié)果類似，芽胞桿菌DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13無(wú)菌發(fā)酵上清液均能抑制油茶炭疽病病原菌絲的生長(zhǎng)，抑菌率最高可達(dá)81.14%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和添加量的增多，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液抑菌效果也逐漸增強(qiáng)。貝萊斯芽胞桿菌SZAD1不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液抑菌效果也不同，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其抑菌圈直徑也逐漸增大，72 h上清液的抑菌圈直徑為48 h的抑菌圈直徑的3倍[21]。因此推測(cè)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵上清液中抑菌活性物質(zhì)的累積也逐漸增多。

前人研究表明，大多數(shù)生防芽胞桿菌對(duì)病原菌菌絲形態(tài)具有一定的影響[22,23]。本研究也發(fā)現(xiàn)短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后的焦腐病菌菌絲較粗，顏色較對(duì)照組略微加深，菌絲體分叉明顯增多、增長(zhǎng)，頂端膨大明顯。暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）LZ88對(duì)煙草褐斑病菌菌絲的形態(tài)也具有一定的影響，并且會(huì)抑制孢子的萌發(fā)[24]。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX可以抑制菌絲在果皮表面生長(zhǎng)，病原菌處理的龍眼果實(shí)表面長(zhǎng)滿菌絲，而短短芽胞桿菌處理后果實(shí)表面菌絲則較少。

植物免疫抗性酶SOD、CAT、PPO等均參與了刺激植物細(xì)胞過敏反應(yīng)和防御反應(yīng)，當(dāng)遭遇不良環(huán)境時(shí)，植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)多種抗性酶的活性，降低逆境對(duì)其造成的傷害[25]。枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）SSR2I處理后，番茄根、莖和葉片的SOD活性明顯提高[26]。本研究結(jié)果與之相似，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后龍眼果實(shí)SOD和CAT活性均顯著高于病原菌處理。李君等[27]也發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌B3處理后，在第5天，核桃葉片中CAT、POD、PPO、活性比對(duì)照分別升高了3.60、1.60、4.56倍。因而推測(cè)，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX可以作為微生物誘導(dǎo)抗性劑進(jìn)行植物病害防治，后續(xù)研究中，將就該菌株對(duì)相關(guān)酶基因表達(dá)影響進(jìn)行深入研究，為其在龍眼焦腐病生物防治提供一定的理論依據(jù)。