豆佳媛，梁馨月，王琪瑞，逯莉

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西西安 712046）

1 引 言

香菇是一種可以藥用也可以食用的菌類，又被稱之為香蕈或者冬菇。香菇是生長在木材上的真菌類，香菇中所蘊(yùn)含的黃酮類成分能夠有效地防止氧化，能夠在一定程度上有效地增強(qiáng)人體整體的免疫力，同時降低人體內(nèi)部的血糖。因此，針對香菇中所蘊(yùn)含的黃酮類成分的研究也成為了近幾年來學(xué)者們所研究的重點(diǎn)。黃酮類化合物是植物在生長過程中受到光合作用的影響所產(chǎn)生的化合物，在其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)中是以C6—C3—C6為主要骨架的有機(jī)物[1]，其存在的形式主要有兩種不同的方式，首先是游離的苷元，其次則是糖等結(jié)合的苷。目前黃酮類化合物在自然界的分布是非常廣泛的，具體地包括了銀杏葉、葛根、薔薇果等，這些植物中都是含有黃酮化合物的，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的接近五千多種的植物中都有著黃酮類的物質(zhì)或者是異黃酮類的物質(zhì)[2]。

目前在許多抗氧化劑中都是采用了黃酮的相關(guān)物質(zhì)，通過進(jìn)一步的分析和研究發(fā)現(xiàn)，在抗氧化作用方面，維生素E 比葡萄籽中總黃酮要弱一點(diǎn)，葡萄籽中總黃酮能夠針對人體皮膚方面的保健發(fā)揮相應(yīng)的作用[3]，也能夠針對炎癥產(chǎn)生一定的消炎作用。隨著相關(guān)研究成果的深入發(fā)展，未來黃酮也會成為人類必須攝取的微量元素。

此次研究中，先分別記錄不同單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，再采用正交試驗(yàn)法設(shè)計優(yōu)化香菇中總黃酮的提取工藝參數(shù)，并與正交設(shè)計表中的數(shù)據(jù)聯(lián)系，進(jìn)行統(tǒng)計，確定最佳實(shí)驗(yàn)方案，為香菇中總黃酮的提取工藝研究提供新的思路。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1供試材料

供試香菇購買于鳳縣嘉陵綠谷農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

2.1.2主要儀器和試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；蒸餾水，自制；SCQ-20 超聲波清洗器，恒奧科技有限公司；TU-1810 紫外分光光度儀，山東瑞利儀器有限公司；GY-753 粉碎機(jī)，天津亞慶粉碎設(shè)備廠；無水乙醇，新鄉(xiāng)市中原有機(jī)化工公司；80-2 型臺式離心機(jī)，常州市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；CY-841 熱風(fēng)循環(huán)烘箱，吳江超宇烘箱制造公司；燒杯等玻璃儀器，四川蜀玻集團(tuán)有限責(zé)任公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)液配制方法

精密稱取蘆丁標(biāo)品0.020 g，并采用60%乙醇溶液對其進(jìn)行溶解，100 mL 定容并震蕩搖晃均勻，通過這樣的方式可以得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，其質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，對這部分溶液進(jìn)行保存待用。完成以上步驟之后利用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 放入到10 mL 比色管中，然后加入60%乙醇溶液定容至4.0 mL，再加入0.5 mL 的濃度為5%的NaNO2溶液，完成此步驟后進(jìn)行搖晃，搖晃均勻，靜置6 min。再加入Al(NO3)3溶液，其濃度為10%，容量為0.5 mL，并進(jìn)行搖晃和靜置，靜置6 min。在此基礎(chǔ)上加入4.0 mL 濃度為5%的NaOH 溶液，再加入60%乙醇溶液定容至刻度，搖晃均勻靜置20 min。并于510 nm 波長處測定吸光度值（其中第1 管為空白對照管）。

2.2.2香菇中總黃酮含量的測定方法

將香菇洗凈，放置到55℃干燥箱，放置6 h，粉碎后過60 目篩，在此基礎(chǔ)上稱取質(zhì)量相同的香菇并且按照計算好的比例，即1∶40 料液比加入乙醇，在200 W 功率的超聲波輔助中提取一定時間后固定在60℃恒溫的水中酶解1 h，再用離心機(jī)在4000 r/min速率下離心10 min。過濾取上清液，得黃酮類化合物粗提液。吸取3.0 mL 粗提液于10 mL 比色管中，測定在510 nm 波長處的吸光度A，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計算出黃酮類化合物的質(zhì)量濃度。

2.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對香菇中總黃酮得率的影響

稱取1 g 香菇粉末五份，分別加入從10%濃度開始每次間隔為10%的乙醇溶液，進(jìn)行超聲波處理流程的時間為25 min，從而篩選出最佳的乙醇濃度。

2.2.3.2 超聲時間對香菇中總黃酮得率的影響

稱取1 g 香菇粉末五份，分別加入40 mL 的40%乙醇，在50℃下超聲提取5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，篩選最佳的超聲波處理時間。

2.2.3.3超聲溫度對香菇中總黃酮得率的影響

稱取香菇粉末5 份，每份為1 g，分別加入40 mL的40%乙醇，在超聲溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件下，提取20 min，篩選出整個提取過程中最佳的超聲溫度。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在研究的過程中以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，在510 nm 波長下測定吸光度，縱坐標(biāo)為吸光度、橫坐標(biāo)為濃度，整體的方程Y ＝9.3984X +0.0427，R2＝0.9975，結(jié)果見圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對香菇中總黃酮提取率的影響

從圖2 中可以看出，乙醇溶液濃度的不同對于黃酮的提取率有著一定程度的影響。當(dāng)乙醇濃度在10%到40%的范圍之內(nèi)時，隨著濃度的不斷提升，黃酮提取率也呈現(xiàn)出上升的趨勢。而當(dāng)乙醇溶液的整體濃度大于40%時，提取率就會出現(xiàn)相應(yīng)的下降趨勢。分析可知，乙醇濃度高于40%會導(dǎo)致香菇中其他有機(jī)物溶出，影響吸光度，導(dǎo)致得率下降。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

3.2.2超聲時間對香菇中總黃酮提取率的影響

從圖3 可以看出，不同超聲時間對于黃酮提取率有著一定程度的影響。超聲時間從5 min 到25 min時，黃酮整體的提取率會出現(xiàn)一個先升高后降低的趨勢，在超聲時間為10 min 時黃酮整體的提取率最高。這可能因?yàn)榇藭r相關(guān)的物料與溶劑已充分接觸，而在10 min 后有其他雜質(zhì)溶出，影響了黃酮吸光度的讀取，所以選擇最佳提取時間為10 min。

圖3 不同超聲時間對黃酮提取率的影響

3.2.3超聲溫度對香菇中總黃酮提取率的影響

從圖4 中可以明顯地看出，隨著超聲溫度的升高，黃酮的提取率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)整體的溫度達(dá)到60℃的時候，提取率就已經(jīng)達(dá)到了整體的最大值，而超過60℃之后呈現(xiàn)出下降的趨勢。具體分析其原因，可能是因?yàn)槌暅囟葧ο愎街械狞S酮造成一定數(shù)量的破壞，同時隨著溫度的升高也可能讓雜質(zhì)的溶出量增加。

圖4 不同超聲溫度對黃酮提取率的影響

3.3 正交試驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)說明，黃酮提取的過程中會受到不同程度的外部環(huán)境和要素的影響，包括了乙醇的濃度、超聲波的作用時間以及超聲水浴的溫度等，因此，為了促進(jìn)整個實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，在實(shí)驗(yàn)的過程中針對這些因素進(jìn)行了具體的分析和考慮，開展了正交實(shí)驗(yàn)，具體的研究結(jié)果如表1—表3 所示。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 各因素對提取率的方差分析結(jié)果

從以上的表格中可以看出整體的提取效果中不同因素所產(chǎn)生的影響，首先最大的影響因素是乙醇的濃度，其次則是超聲溫度，最后是超聲時間。由此可以看出提取率最為直觀的有效組合是A2B3C3，即乙醇濃度40%、超聲時間15 min、超聲溫度60℃。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

精密稱取處理后的香菇粉末5 g，置于容器中，按照正交最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A2B3C3）,即乙醇濃度40%、超聲時間15 min、超聲溫度60℃，依照2.2.3 中的方法進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)。三次試驗(yàn)結(jié)果分別為0.302%、0.296%、0.314%。三次試驗(yàn)結(jié)果均值為0.304%，提取率高于其他8 組正交試驗(yàn)，但相比于第5 組實(shí)驗(yàn)略有下降。由此可見，超聲時間的延長并不能使提取率實(shí)現(xiàn)完全正向增長，而在10 min時效果最佳。因此，確定乙醇濃度40%、超聲時間10 min、超聲溫度60℃為最佳提取工藝。

4 結(jié)論與展望

通過單因素以及正交實(shí)驗(yàn)法，對乙醇的濃度、超聲時間以及相應(yīng)的超聲溫度進(jìn)行重新的組合和優(yōu)化，在這個過程中以總黃酮提取率作為相應(yīng)的評價指標(biāo)，有效地分析了現(xiàn)階段超聲波輔助提取香菇中的黃酮類物質(zhì)的提取工藝，得到香菇中總黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝，即乙醇濃度為40%，超聲的時間控制在10 min，溫度條件控制在60℃左右，在這樣環(huán)境之下總黃酮提取率為0.310%。這說明通過改變提取劑乙醇的濃度、超聲的溫度和時間能夠有效提高香菇中黃酮提取率，同時超聲波技術(shù)應(yīng)用于香菇中黃酮的提取具有時間短、效率高、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，適合用于香菇總黃酮提取工藝，為香菇的進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)天然的、無毒副作用的保健品提供了理論依據(jù)，使得香菇中總黃酮成分的提取具有一定的發(fā)展前景。