蕁麻根質(zhì)量標(biāo)志物研究

陳 艷，李曉波，賈祎萍，胡 海，王夢(mèng)月

上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240

蕁麻根為蕁麻科植物蕁麻UrticafissaPritz、寬葉蕁麻U.laetevirensMaxim.、狹葉蕁麻U.angustifoliaFisch.et Hornem.、麻葉蕁麻U.cannabinaL.等的干燥根。具有祛風(fēng)，活血，止痛之功效，常用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕、蕁麻疹、濕疹，但缺乏質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)研究[1,2]。因此，蕁麻根的質(zhì)量標(biāo)志物研究具有重要意義。

前期的化學(xué)成分研究表明，裂環(huán)木脂素為蕁麻根特征性成分[3-7]。其中，蕁麻醇-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱蕁麻醇苷，見(jiàn)圖1)為主要裂環(huán)木脂素成分[3,6]。本文對(duì)蕁麻醇苷的生物活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗炎、抗氧化、抗補(bǔ)體作用，可以作為蕁麻質(zhì)量標(biāo)志物；接著，對(duì)蕁麻醇苷的波譜特征進(jìn)行了較系統(tǒng)研究，補(bǔ)充了UV、IR、CD、NMR等波譜數(shù)據(jù)；最后，建立了蕁麻醇苷的HPLC測(cè)定方法，為蕁麻根的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 蕁麻醇苷結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of urticoside

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蕁麻根采自四川、重慶、云南、新疆、廣西，均經(jīng)王夢(mèng)月副教授鑒定，憑證標(biāo)本(UR1～UT19)保存于上海交通大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 藥品及試劑

蕁麻醇苷(自制，經(jīng)HPLC分析純度為98.8%)；RAW 264.7細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；甲醇、乙醇、正丁醇、二氯甲烷(分析純，上海凌峰)；乙腈、甲醇(色譜純，上海百靈威)；肝素鈉、地塞米松(國(guó)藥集團(tuán))；MTT、LPS(Sigma)；RPMI 1640 培養(yǎng)基、DPPH、trolox(北京伊諾凱)；NO、IL-1、TNF-α、ABTS及FRAP試劑盒(南京建成)；豚鼠血清、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)購(gòu)自上海生物工程公司；薄層層析硅膠G板、柱色譜用硅膠(200～300目，青島海洋)；凝膠Sephadex LH-20(瑞士Amersham Pharmacia)；ODS 反相硅膠(40～63 μm，德國(guó)默克)；超純水(美國(guó)Millipore)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Bruker AVANCE 700 MHz核磁共振儀(德國(guó)Bruker，配有5 mm1H/13C/15N超低溫探頭)。Agilent 1200分析型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent)，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、Shim-pack VP-ODS色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；EYELA N-101型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)； DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒)；BS300S型電子天平(北京賽多利斯)；Varioskan LUX 酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛)；Agilent 1290 UPLC-Q-TOF 質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó) Agilent)；Nicolet 6700 傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher)；P-2000型全自動(dòng)數(shù)字旋光儀、J-1500多功能圓二色譜儀(日本JASCO)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蕁麻醇苷的生物活性

樣品分別用RPMI 1640培養(yǎng)基(用于抗炎活性測(cè)試)、5%甲醇溶解(用于抗氧化、抗補(bǔ)體活性測(cè)定)，配成0.2、1.0、5.0、20.0、100、500 μM溶液。

2.1.1 抗炎活性測(cè)定

2.1.1.1 細(xì)胞毒考察

用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，以培養(yǎng)液稀釋為1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后加入各濃度藥液100 μL，MTT法考察樣品的細(xì)胞毒性。

2.1.1.2 炎癥因子測(cè)定

RAW 264.7 細(xì)胞懸液接種96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基。加入LPS，使各組LPS終濃度為5 μg/mL。分別加入各濃度的藥液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，試劑盒檢測(cè)上清NO、IL-1、TNF-α釋放量，計(jì)算不同濃度樣品的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)[8]。

2.1.2 抗氧化作用

2.1.2.1 清除DPPH活性測(cè)定

不同濃度的樣品加入適量的DPPH甲醇溶液，混勻后避光放置30 min 后于517 nm 下測(cè)定吸光度(A)。同時(shí)，設(shè)置空白組(以等體積的甲醇代替DPPH溶液)和對(duì)照組(以等體積的甲醇代替樣品)，并以trolox代替供試品作為陽(yáng)性對(duì)照組。計(jì)算不同濃度樣品的DPPH清除率(清除率=[1-(A供試品-A空白)/A對(duì)照]× 100%)及半數(shù)清除濃度(EC50)。

2.1.2.2 清除ABTS活性測(cè)定

ABTS自由基清除活性測(cè)定參照試劑盒使用方法。配制過(guò)氧化氫溶液和過(guò)氧化物酶、ABTS工作液，取適量過(guò)氧化物酶工作液與不同濃度樣品輕輕混勻，再加入適量ABTS工作液混勻，室溫孵育6 min后在414 nm下測(cè)定A值。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(以等體積甲醇代替樣品)，以trolox為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算不同濃度樣品的ABTS清除率及EC50[9]。

2.1.3 抗補(bǔ)體作用

2.1.3.1 經(jīng)典途徑

樣品用BBS 緩沖液稀釋，加入臨界濃度的補(bǔ)體(1∶80稀釋的豚鼠血清)、溶血素、2% SRBC。37 ℃水浴30 min，離心后取上清液在405 nm下測(cè)定A值。同時(shí)，設(shè)置對(duì)照組(等量的供試品加入BBS 緩沖液中，用于測(cè)定本底A 值)、補(bǔ)體組(臨界濃度的補(bǔ)體直接加入BBS 緩沖液、溶血素和2% SRBC，用于測(cè)定臨界濃度補(bǔ)體所造成紅細(xì)胞溶血的A 值)、全溶血組(2% SRBC加入水中使之全溶血，用于觀察補(bǔ)體組是否達(dá)到或接近全溶血水平)、陽(yáng)性對(duì)照組。計(jì)算不同濃度樣品的溶血抑制率(溶血抑制率=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A全溶血] × 100%)及CH50(經(jīng)典途徑50%抑制溶血所需供試品濃度)。

2.1.3.2 旁路途徑

取臨界濃度的補(bǔ)體(1∶4稀釋的人血清)分別與不同濃度的樣品混勻，加入適量的AP緩沖液和0.5%兔紅細(xì)胞。37 ℃水浴30 min，離心后取上清液在405 nm下測(cè)定A。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組、補(bǔ)體組、全溶血組、陽(yáng)性對(duì)照組。計(jì)算不同濃度樣品的溶血抑制率及AP50(旁路途徑50%抑制溶血所需濃度)[10]。

2.2 蕁麻醇苷的波譜特征

2.2.1 旋光度

取樣品10.0 mg，溶于1.0 mL甲醇，采用旋光儀測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)589 nm。

2.2.2 紫外、CD光譜

樣品分別用甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈溶解，配成0.05 mg/mL溶液。紫外分光光度計(jì)記錄樣品紫外吸收曲線，并計(jì)算摩爾吸收系數(shù)；ECD 光譜儀測(cè)定CD譜。

2.2.3 紅外光譜

溴化鉀壓片，用紅外光譜儀在4 000 ～ 600 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描，繪制紅外圖譜。

2.2.4 質(zhì)譜

樣品溶于甲醇，采用Agilent 1290 UPLC-Q-TOF-MS進(jìn)行測(cè)定，正離子模式檢測(cè)。

2.2.5 NMR譜

樣品4.0 mg加入0.5 mL DMSO-d6，在Bruker 700 MHz NMR儀上測(cè)定1H譜、13C譜及二維譜(HSQC、1H-1H COSY、HMBC、NOESY)。

另取樣品4.0 mg，分別加入0.5 mL CD3OD、C5D5N、Acetone-d6，在Bruker 700 NMR儀上測(cè)定1H譜、13C譜及二維譜(HSQC、1H-1H COSY、HMBC)。

2.3 蕁麻醇苷的HPLC測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備

取樣品粉末約2 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，80 ℃水浴回流提取2次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?、定容?5 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取蕁麻醇苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蕁麻醇苷0.285 mg的溶液。

2.3.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相，洗脫程序?yàn)椋?～10 min 10%A、10～20 min 10%A→35%A、20～50 min 35%A→40%A；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.4 線性關(guān)系考察

將濃度為0.285 mg/mL的蕁麻醇苷溶液分別稀釋2倍、10倍、20倍、80倍得到不同濃度的對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)進(jìn)樣分析。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰峰面積。

2.3.6 穩(wěn)定性考察

取樣品粉末約2 g，精密稱定，按2.3.1項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、24 h各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次蕁麻粉末6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密取已知蕁麻醇苷含量的樣品6份，每份約1 g，精密稱定，加入蕁麻醇苷對(duì)照品溶液，按“2.3.1”方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 蕁麻醇苷的生物活性

對(duì)蕁麻醇苷進(jìn)行了抗炎、抗補(bǔ)體、抗氧化活性評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蕁麻醇苷對(duì)RAW 264.7細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性，濃度達(dá)250 μM時(shí)，細(xì)胞存活率超過(guò)91.3%；蕁麻醇苷具有較強(qiáng)的抗炎作用，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO、IL-1、TNF-α等炎癥介子(半數(shù)抑制濃度均低于16 μM)；蕁麻醇苷能顯著清除DPPH、ABTS等自由基，其作用與陽(yáng)性對(duì)照trolox相當(dāng)，顯示出良好的抗氧化作用；蕁麻醇苷還具有良好的抗補(bǔ)體活性，對(duì)經(jīng)典途徑和旁路途徑均有作用(見(jiàn)圖2)。上述結(jié)果表明蕁麻醇苷具有與蕁麻根抗風(fēng)濕作用直接相關(guān)的生物活性，可作為蕁麻質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

圖2 蕁麻醇苷生物活性Fig.2 The biological activities of urticoside

3.2 蕁麻醇苷的波譜特征

3.2.1 旋光度

3.2.2 紫外光譜

樣品用3種溶劑測(cè)試，結(jié)果如下UV(MeOH)λmax(ε)：235(10 070)，280(5 061)nm；UV(MeOH)λmax(ε)：236(8 835)，284(4 458)；UV(MeOH)λmax(ε)：235(6 378)，280(3 341)。在282、240 nm左右處均顯示出取代苯環(huán)的特征吸收峰。進(jìn)一步比較甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈中測(cè)試的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)測(cè)試溶劑對(duì)最大吸收波長(zhǎng)及摩爾吸收系數(shù)有明顯影響。

3.2.3 紅外光譜

樣品在3 414 cm-1處有一寬強(qiáng)峰，為羥基伸縮振動(dòng)峰。在2 918 cm-1處的吸收峰為亞甲基伸縮振動(dòng)峰。在2 850、1 271 cm-1處分別有一尖峰、強(qiáng)峰，說(shuō)明含有-OCH3，且-OCH3與苯環(huán)相連。1 751 cm-1處的強(qiáng)峰為飽和γ-飽和內(nèi)酯中羰基的特征吸收峰。在1 515 cm-1處有明顯吸收峰，為芳環(huán)特征峰。此外，樣品在1 047、1 003 cm-1均有寬強(qiáng)峰，說(shuō)明含有仲醇、叔醇結(jié)構(gòu)。

3.2.4 質(zhì)譜

HR-ESI-MS正離子模式給出準(zhǔn)分子離子峰m/z554.223 1 [M + NH4]+(calcd for C26H36NO12，554.223 8)；此外，還在m/z1 095.368 1處出現(xiàn)[2M + Na]+峰(calcd.for C52H64O24Na，1 095.368 5)。

3.2.5 圓二色譜

樣品甲醇溶液在237、286 nm處均呈正Cotton效應(yīng)(圖3)，與(3S，4R)蕁麻醇-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷高斯計(jì)算結(jié)果一致。

圖3 蕁麻醇苷CD圖Fig.3 The CD spectrum of urticoside

3.2.6 核磁共振譜

樣品1H NMR(DMSO-d6，700 MHz)中出現(xiàn)32個(gè)氫信號(hào)，其中：芳?xì)?個(gè)、6個(gè)活潑氫、2個(gè)甲氧基質(zhì)子；H-3和H-4之間較小的偶合常數(shù)(J< 7.0 Hz)提示C-3和C-4是反式連接。NOESY譜中未觀察到H-3 和H-4之間的相關(guān)峰，進(jìn)一步表明C-3和C-4是反式連接。端基質(zhì)子(H-1′′′)的偶合常數(shù)(J> 7.0 Hz)，提示葡萄糖為β構(gòu)型。13C NMR(DMSO-d6，175 MHz)中出現(xiàn)26個(gè)碳信號(hào)(其中，C-4信號(hào)與溶劑重疊；葡萄糖基6個(gè))。根據(jù)HMBC、HSQC、1H-1H COSY、NOESY等二維譜，核磁數(shù)據(jù)歸屬結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 測(cè)試溶劑對(duì)蕁麻醇苷 13C NMR的影響(175 MHz)

進(jìn)一步比較了不同溶劑對(duì)1H、13C NMR譜的影響，結(jié)果表明：不同溶劑對(duì)13C NMR譜有明顯影響，部分碳化學(xué)位移相差2以上，如：羰基碳(C-2)在氘代甲醇和氘代丙酮中相差2.5 ppm；糖基上的6個(gè)碳在氘代吡啶和氘代DMSO-d6中均相差2 ppm以上(見(jiàn)表1)。相對(duì)于碳譜，不同溶劑對(duì)1H NMR譜影響更大，不僅影響偶合常數(shù)，且顯著影響非芳環(huán)質(zhì)子的化學(xué)位移(這些質(zhì)子在DMSO-d6和C5D5N中化學(xué)位移甚至相差0.8 ppm以上(見(jiàn)表2)。

表2 測(cè)試溶劑對(duì)蕁麻醇苷的1H NMR影響(700 MHz)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.3 HPLC含量測(cè)定

3.3.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

對(duì)照品和代表性供試品溶液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖4，顯示色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果良好。

圖4 對(duì)照品(A)及樣品(B)HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of reference (A) and Urticae Rhizomae (B)

3.3.2 線性關(guān)系考察

蕁麻醇苷在3.562 5×10-3～ 0.285 mg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為Y= 34.96X-15.09(r2= 0.999 6)。

3.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積的RSD為0.87%，表明精密度良好。

3.3.4 穩(wěn)定性考察

結(jié)果蕁麻醇苷峰面積的RSD為1.80%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果蕁麻醇苷峰面積的RSD為0.85%，表明重復(fù)性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

平均回收率為103.72%，RSD值為1.6%，表明該方法準(zhǔn)確度良好(見(jiàn)表3)。

表3 加樣回收率結(jié)果(n = 6)

3.3.7 樣品測(cè)定結(jié)果

不同品種的蕁麻根中蕁麻醇苷含量有明顯差異。所測(cè)定樣品，麻葉蕁麻根的含量明顯高于其他品種。同一品種不同產(chǎn)地，蕁麻醇苷的含量也有明顯差異。蕁麻科蝎子草屬植物蝎子草Girardiniasuborbiculata在四川、云南等地亦作蕁麻藥用，但未檢出蕁麻醇苷(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明蕁麻醇苷可作為蕁麻根質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)志物。

表4 蕁麻醇苷含量測(cè)定結(jié)果

4 討論與結(jié)論

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為常見(jiàn)疾病，其發(fā)病機(jī)理不清，現(xiàn)代研究表明多與炎癥介質(zhì)釋放、補(bǔ)體過(guò)度激活、氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。蕁麻根為常用民族藥，在漢、藏、彝、苗、羌、土家、布依、維吾爾、瑤、傈僳、納西族等11個(gè)民族藥用，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，療效確定，安全無(wú)毒。但其質(zhì)量標(biāo)志物研究未見(jiàn)報(bào)道。

蕁麻根主要成分為1，7-裂環(huán)木脂素類成分。該類成分分布局限，是蕁麻的特征性成分。其中，蕁麻醇苷是蕁麻的主要成分。本文根據(jù)蕁麻根治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕的傳統(tǒng)功效，對(duì)其進(jìn)行了抗炎、抗補(bǔ)體、抗氧化等相關(guān)活性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕁麻醇苷具有顯著的抗炎、抗氧化、抗補(bǔ)體，為蕁麻根的主要活性成分及特征性成分，可以作為蕁麻質(zhì)量標(biāo)志物。

在此基礎(chǔ)上，本論文對(duì)其進(jìn)行了較系統(tǒng)的波譜研究。首次對(duì)蕁麻醇苷UV、IR、CD進(jìn)行了研究，補(bǔ)充了相關(guān)波譜數(shù)據(jù)，考察了不同測(cè)試溶劑對(duì)NMR、UV的影響，發(fā)現(xiàn)不同溶劑對(duì)NMR、UV均有顯著影響。

最后，論文對(duì)蕁麻醇苷的HPLC測(cè)定方法進(jìn)行了研究，建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏。不同品種、不同產(chǎn)地的蕁麻根含量差異明顯，結(jié)果進(jìn)一步表明蕁麻醇苷可以用于蕁麻根的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

致謝：上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心代博娜博士完成NMR測(cè)試。