梁慧賢，閆鶴

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

肺炎克雷伯菌是一種引起人與動(dòng)物感染條件致病菌[1]，在獸醫(yī)臨床上，肺炎克雷伯菌可以引起豬發(fā)病，已成為規(guī)?；i場(chǎng)病原菌之一[2]，其對(duì)豬場(chǎng)造成的危害不容忽視。豬感染肺炎克雷伯菌會(huì)引發(fā)多種器官組織病變，導(dǎo)致極高的致病率和致死率[3]。國(guó)內(nèi)外都有報(bào)道豬場(chǎng)發(fā)生豬感染肺炎克雷伯菌大爆發(fā)的事件，引起豬感染疾病進(jìn)而死亡，給豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]?，F(xiàn)階段，研究者主要探究豬源肺炎克雷伯菌的耐藥性[2,6-7]，其毒力因子的攜帶情況以及毒力因子與進(jìn)化之間的關(guān)系缺乏完整的研究。

肺炎克雷伯菌在感染宿主過(guò)程可通過(guò)毒力因子起到自身免疫防御的效果，從而使肺炎克雷伯菌成功入侵宿主細(xì)胞，進(jìn)而存活、增殖[8]。根據(jù)肺炎克雷伯菌侵染過(guò)程，相關(guān)毒力因子分為五類：莢膜、脂多糖、菌毛（1 型菌毛以及3 型菌毛）、鐵載體因子（腸桿菌素、耶爾森菌素、氣桿菌素、沙門菌素）[8]以及細(xì)菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS)[9]。第一類毒力因子莢膜是包裹細(xì)胞的多糖基質(zhì)，是肺炎克雷伯菌必需的毒力因子[10]。莢膜由位于染色體上的莢膜多糖基因簇（wzi、wza、wzb、wzc、gnd、wca、cpsB/manB、cpsG/manC和galF）合成[11]，莢膜合成的調(diào)控基因rcsA和rcsB可以增加莢膜的合成[8]。第二類毒力因子脂多糖（LPS）也稱為內(nèi)毒素，是所有革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要和必要的成分[8]。第三類毒力因子菌毛是肺炎克雷伯菌粘附的重要介質(zhì)，在肺炎克雷伯菌中，1 型和3 型菌毛是主要的具有致病性的粘附因子。1 型菌毛是細(xì)菌細(xì)胞表面上的細(xì)絲狀突起[12]，由基因簇fimBEACDFGHK編碼；3 型菌毛則是細(xì)菌細(xì)胞表面上的螺旋狀細(xì)絲，由mrkABCD基因簇編碼[13]，與生物膜形成有關(guān)[14]。第四類毒力因子鐵載體因子，包括腸桿菌素、耶爾森菌素、氣桿菌素和沙門菌素。腸桿菌素被認(rèn)為是肺炎克雷伯菌主要的鐵吸收系統(tǒng)[15]，生物合成與基因簇entABCDEF和編碼介導(dǎo)其轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)基因簇fepABCDG有關(guān)[16]。最后一類是VI 型分泌系統(tǒng)（T6SS），是一種屬于多功能收縮注射系統(tǒng)（CIS）的多蛋白的裝置[17]，作為一種新型的毒力因子，在重塑細(xì)菌群落中和直接或間接地在發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用[18]。越來(lái)越多的研究表明，豬源肺炎克雷伯菌攜帶多種毒力因子，其毒力威脅不容忽視。Liu 等[19]發(fā)現(xiàn)中國(guó)四川省豬場(chǎng)分離的1 株豬源高毒力肺炎克雷伯菌SCsl1，攜帶含有耶爾森氏菌高致病島的新型整合和結(jié)合元件。Chen 等[20]報(bào)道了從豬肺組織中分離的肺炎克雷伯菌ZYST1 中攜帶含有兩個(gè)T6SS 基因簇的新的多重耐藥和毒力元件。攜帶多種毒力因子的豬源肺炎克雷伯菌給獸醫(yī)臨床提出新的挑戰(zhàn)。

全基因組序列正迅速成為預(yù)測(cè)肺炎克雷伯菌的毒力因子的有利工具，尤其是對(duì)于了解相關(guān)菌株基因特征和進(jìn)化關(guān)系具有重要意義[21]。國(guó)內(nèi)外已有研究者通過(guò)全基因組測(cè)序方法研究肺炎克雷伯菌的毒力因子攜帶情況[20,22]。基于7 個(gè)管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB）的核苷酸序列的多位點(diǎn)序列分型（Mutilocus sequence typing，MLST）方法常用于肺炎克雷伯菌的進(jìn)化分析[23]。

鑒于目前對(duì)豬源ST37 型肺炎克雷伯菌攜帶的毒力基因與進(jìn)化之間的關(guān)系尚缺乏了解。因此本研究基于全基因組測(cè)序，對(duì)一株多重耐藥豬源ST37 型肺炎克雷伯菌KP200 和不同來(lái)源的160 株ST37 型肺炎克雷伯菌進(jìn)行比較毒力因子分析，并進(jìn)一步通過(guò)菌株比較基因組分析分析，探究菌株毒力與遺傳進(jìn)化關(guān)系的相關(guān)性，為全面掌握肺炎克雷伯菌的毒力因子提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

肺炎克雷伯菌KP200 分離自廣東省某養(yǎng)豬場(chǎng)的患腹瀉的豬的肝臟。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，KP200 對(duì)頭孢西汀、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢噻吩、苯唑西林、氨曲南、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明以及紅霉素表現(xiàn)出耐藥，對(duì)多粘菌素B、美羅培南以及亞胺培南敏感。

1.2 相關(guān)試劑

Luria-Bertani 液體培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTPs、緩沖液、瓊脂糖，日本TaKaRa 公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒，Marker DL2000，北京博邁德生物技術(shù)有限公司；核酸染料，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.3 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增

通過(guò)細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。使用16S rRNA 基因全長(zhǎng)通用引物，引物序列為 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增目標(biāo)條帶，預(yù)期條帶大小為1500 bp。PCR 反應(yīng)體系及條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。將符合預(yù)期模板大小的擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序，然后將得到的16S rDNA 序列提交到（National Center for Biotechnology Information）NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 在線分析。

1.4 全基因組測(cè)序與注釋

肺炎克雷伯菌KP200 通過(guò)Illumina MiSeq 和Pacbio RS II 測(cè)序儀進(jìn)行全基因組測(cè)序。測(cè)序所得raw reads 序列使用SPAdes v3.9.0 和Canu v1.4 軟件進(jìn)行組裝，并通過(guò)PGAP（Prokaryotic genome annotation pipeline）進(jìn)行基因預(yù)測(cè)與功能注釋。采用Glimmer 3.02軟件進(jìn)行開放閱讀框（Open reading frame，ORF）預(yù)測(cè)，將所有預(yù)測(cè)蛋白序列與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)NR、Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)、eggNOG（Evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp（E＜1e-10）比對(duì)，完成蛋白序列功能注釋。

1.5 MLST 分析

根據(jù)PasteurMLST 數(shù)據(jù)庫(kù)，確定7 個(gè)管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）的等位基因號(hào)，得出肺炎克雷伯菌KP200 菌株的ST 型別。

1.6 毒力因子分析

使用毒力因子Virulence Factors of Pathogenic Bacteria（VFDB）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)肺炎克雷伯菌KP200 和NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中所有ST37 型肺炎克雷伯菌（160 株），進(jìn)行毒力因子分析。

1.7 單拷貝基因組進(jìn)化

通過(guò)prokka v1.14.6（默認(rèn)參數(shù)）[24]獲得肺炎克雷伯菌KP200 和160 株ST37 型肺炎克雷伯菌的注釋基因文件和蛋白文件。統(tǒng)一使用orthofinder v2.4.0[25]（推薦參數(shù)）得到161 株菌株的單拷貝同源蛋白序列文件，接著使用muscle v3.8.31[26]（推薦參數(shù)）進(jìn)行多蛋白序列比對(duì)，最后使用默認(rèn)參數(shù)的MEGA X[27]構(gòu)建單拷貝核心同源蛋白序列Maximum-likelihood（ML）進(jìn)化樹，Bootstrap 值設(shè)置為1000 次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

肺炎克雷伯菌KP200 和160 株ST37 型肺炎克雷伯菌攜帶的毒力基因攜帶情況進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)，包括單個(gè)毒力基因的攜帶菌株數(shù)以及每株菌攜帶毒力因子的種類數(shù)。基于單拷貝基因組進(jìn)化樹聚類，將161 株ST37 型肺炎克雷伯菌存在差異的毒力基因以熱圖的形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 肺炎克雷伯菌KP200 基因組的基本特征

肺炎克雷伯菌KP200 的基因組全長(zhǎng)為5257665 bp，平均GC 含量為58.78%，共有5106 個(gè)編碼基因，基因組測(cè)序的圈圖如圖1 所示。根據(jù)PasteurMLST 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)7 個(gè)管家基因（rpoB-1、gapA-2、mdh-2、pgi-1、phoE-13、infB-9和tonB-16），確定肺炎克雷伯菌KP200的分型為ST37。盡管ST37 型肺炎克雷伯菌不屬于某一特定的克隆群，但ST37 型是耐廣譜β-內(nèi)酰胺臨床肺炎克雷伯菌的重要型別[19,26]。

圖1 肺炎克雷伯菌KP200 全基因組染色體圈圖Fig.1 Circular map of Klebsiella pneumoniae KP200 chromosome

2.2 161 株肺炎克雷伯菌的毒力基因預(yù)測(cè)結(jié)果

研究表明，ST37 型是耐廣譜β-內(nèi)酰胺臨床分離株中常見(jiàn)型別[19,28]，因此需要進(jìn)一步全面掌握該型別攜帶的毒力因子。NCBI 目前已有的160 株ST37 型肺炎克雷伯菌，其中來(lái)自人源（109 株），未知來(lái)源（33株），雞源（9 株），環(huán)境來(lái)源（8 株）以及食品（1 株）。目前為止，只有KP200 為豬源的ST37 型肺炎克雷伯菌。目前大多數(shù)研究主要集中于臨床肺炎克雷伯菌的毒力情況進(jìn)行分析[29-30]。盡管有研究對(duì)寵物醫(yī)院的ST37 型肺炎克雷伯菌攜帶的耐藥基因情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)[31]，但是目前沒(méi)有針對(duì)豬源ST37 型肺炎克雷伯菌的毒力因子攜帶情況進(jìn)行分析的研究。161 株肺炎克雷伯菌經(jīng)過(guò)毒力因子分析，共發(fā)現(xiàn)76 種毒力因子，其中19 種毒力因子為所有菌株共有的。161 株菌種都攜帶的21 種毒力基因分別為：1 型菌毛基因fimACFGI、3型菌毛基因mrkDCHJ、腸桿菌素entABCEF和fepABC、莢膜合成調(diào)節(jié)基因rcsAB。

針對(duì)差異的毒力基因分析表明（圖2），莢膜相關(guān)基因在161 株菌中分布存在差異：133 株菌攜帶cpsACP基因，158 株菌攜帶galF基因，109 株菌攜帶gnd基因，118 株菌攜帶ugd基因，81 株菌攜帶manBC基因，然而包括KP200 在內(nèi)的161 株ST37 型肺炎克雷伯菌中存在莢膜基因的缺失。研究表明，與無(wú)莢膜的肺炎克雷伯菌相比，有莢膜的肺炎克雷伯菌被先天免疫細(xì)胞吞噬的可能性更低[32]。LPS 相關(guān)基因在161株菌中分布同樣存在差異，其中11 株菌攜帶glf、wbbM、wbbO、wzm、wzt基因，9 株菌攜帶kfoC基因，12 株菌攜帶wbbN基因，攜帶完整LPS 毒力因子的菌株共有9 株。結(jié)果表明，包括KP200 在內(nèi)的大多數(shù)ST37 型肺炎克雷伯菌存在LPS 合成相關(guān)的基因缺失，可能導(dǎo)致毒力減弱[33]。

1 型菌毛編碼基因簇fimBEACDFGHK在161 株菌中分布存在差異（圖2），158 株菌攜帶1 型菌毛基因fimH；160 株菌攜帶1 型菌毛基因fimDE；157 株菌攜帶1 型菌毛基因fimB，只有KP200 和來(lái)自中國(guó)臨床肺炎克雷伯菌5422 兩株菌攜帶1 型菌毛基因fimK，該基因一般認(rèn)為其功能涉及1 型纖維調(diào)節(jié)[34]，進(jìn)一步分析得出攜帶完整的1 型菌毛基因fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI和fimK的菌株只有KP200 和5422。而研究表明，在90%的臨床和環(huán)境肺炎克雷伯菌分離株中以及幾乎所有的腸桿菌科菌株中表達(dá)1 型菌毛[12]。3 型菌毛攜帶情況：159 株菌攜帶3 型菌毛基因mrkA，158 株菌攜帶3 型菌毛基因mrkB，160 株菌攜帶3 型菌毛基因mrkFI，因此共有包括KP200 在內(nèi)的158 株菌攜帶完整的編碼3 型菌毛基因mrkABCD。在3 型菌毛中，大部分的結(jié)構(gòu)由mrkA亞基和位于尖端的粘附素mrkD組成?；騧rkBCE參與組裝和表達(dá)調(diào)控，而mrkF參與菌毛的表面穩(wěn)定性[35]。據(jù)報(bào)道，檢測(cè)3 型菌毛基因主要針對(duì)基因mrkD的檢測(cè)[36-37]。

圖2 161 株肺炎克雷伯菌毒力基因分布圖Fig.2 Results of virulence factors detection for the 161 isolates of Klebsiella pneumoniae

鐵載體因子分析結(jié)果表明（圖2），161 株肺炎克雷伯菌基因組均攜帶entABCEF和fepABC腸桿菌素基因，僅entD、fepD、fepG、fes和ybdA在161 株肺炎克雷伯菌的分布存在差異，進(jìn)一步分析得出腸桿菌素相關(guān)基因存在于所有的ST37 型肺炎克雷伯菌中，與Paczosa 等[8]的研究結(jié)果相符。針對(duì)沙門菌素分析，僅有KP200 和其他15 株肺炎克雷伯菌攜帶iroN沙門菌素基因。據(jù)報(bào)道，檢測(cè)沙門菌素主要針對(duì)基因iroB[38]和iroN[39]的檢測(cè)。KP200 不攜帶攜帶耶爾森桿菌素相關(guān)基因，26.09%（42/161）的菌株攜帶耶爾森桿菌素相關(guān)基因，Hsieh 等[16]研究發(fā)現(xiàn)僅18%的非高毒力肺炎克雷伯菌攜帶耶爾森桿菌素，說(shuō)明ST37 型肺炎克雷伯菌的毒力值得關(guān)注。161 株肺炎克雷伯菌基因組中，僅有包括肺炎克雷伯菌KP200在內(nèi)的16株攜帶氣桿菌素轉(zhuǎn)運(yùn)基因iutA，常作為識(shí)別高毒力肺炎克雷伯菌的特征基因之一[38]。研究發(fā)現(xiàn)，僅有6%的非高毒力的臨床肺炎克雷伯菌發(fā)現(xiàn)氣桿菌素[40]，而本次研究中僅有2.48%（4/161）攜帶完整編碼氣桿菌素基因iucABCD-iutA。

本研究是首次探討ST37型肺炎克雷伯菌T6SS的基因攜帶情況。對(duì)T6SS 相關(guān)基因分析表明（圖2），KP200 攜帶完整的T6SS 基因，161 株肺炎克雷伯菌攜帶T6SS 基因存在差異：55 株菌攜帶tssJFG基因，158 株菌攜帶tssKBCDL基因，37 株菌攜帶tssI基因，157 株菌攜帶tssH基因，2 株菌攜帶tssM基因。該結(jié)果與Storey 等[9]對(duì)全球700 個(gè)基因組進(jìn)行T6SS 基因?qū)Ρ确治鼋Y(jié)果相似：T6SS 基因在整個(gè)肺炎克雷伯菌中具有廣泛的多樣性。更有研究發(fā)現(xiàn)，豬源肺炎克雷伯菌除了攜帶兩個(gè)T6SS 基因簇外還攜帶相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控蛋白同源物tfoX和qstR以及自然感受態(tài)蛋白comEA和comEC，有利于肺炎克雷伯菌的殺傷作用和吸收外來(lái)DNA 的作用[20]。

161 株肺炎克雷伯菌攜帶的毒力因子的種類統(tǒng)計(jì)的分析結(jié)果可以看出（圖3），所有菌株都攜帶5 類以上毒力因子，其中僅有未知來(lái)源肺炎克雷伯菌AR_0139 攜帶9 類毒力因子，4 株人源菌株（肺炎克雷 伯 菌 AS012426、3189STDY5864948、3189STDY5864949 以及PB86）僅攜帶5 類毒力因子，攜帶6 類毒力因子的菌株數(shù)量最多為102 株。該結(jié)果比Kim 等[41]通過(guò)PCR 檢測(cè)的分離自肝膿腫病人糞便的ST37 型肺炎克雷伯菌攜帶的毒力因子種類多。同樣地，本研究結(jié)果比Shao 等[42]通過(guò)PCR 檢測(cè)的分離自重癥新生兒血液的ST37 型肺炎克雷伯菌攜帶的毒力因子種類多。本研究與其他研究者的研究結(jié)果存在差異可能是由于僅通過(guò)PCR 檢測(cè)的毒力因子種類較少，不能全面地反映ST37 型肺炎克雷伯菌攜帶毒力因子種類，表明了本研究基于全基因組序列研究ST37型肺炎克雷伯菌攜帶毒力因子種類情況的重要意義。

圖3 161 株ST37 型肺炎克雷伯菌毒力因子攜帶情況Fig.3 The virulence factors of 161 Klebsiella pneumoniae isolates

2.3 單拷貝基因組進(jìn)化分析與毒力情況的關(guān)系

目前，基于全基因組進(jìn)化方法分析菌株之間的進(jìn)化關(guān)系已較為普遍，但對(duì)于肺炎克雷伯菌主要是研究臨床爆發(fā)菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，尚未將ST37 型菌株的毒力情況與進(jìn)化關(guān)系相結(jié)合進(jìn)行研究。161 株ST37型肺炎克雷伯菌共檢測(cè)到2563 個(gè)單拷貝基因，基于單拷貝基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明（圖4），161 株ST37 型肺炎克雷伯菌主要位于四個(gè)不同的分支。該結(jié)果與Zhang 等[43]對(duì)分離自家禽生產(chǎn)環(huán)境中ST37 型肺炎克雷伯菌的進(jìn)化結(jié)果相似。本研究將毒力基因型與單拷貝基因組進(jìn)化關(guān)系相對(duì)應(yīng)（圖4）。結(jié)果顯示，KP200 位于第四個(gè)分支，且與其他來(lái)自人源的5 株肺炎克雷伯菌形成一個(gè)簇，它們攜帶的毒力因子分布大致相同，親緣關(guān)系較近。該結(jié)果與Yang 等[44]對(duì)分離自牛和人的肺炎克雷伯菌的進(jìn)化分析結(jié)果相似：牛源肺炎克雷伯菌分離株與人源肺炎克雷伯菌分離株高度混合。除此之外，含氣桿菌素毒力基因的3株來(lái)自中國(guó)的環(huán)境樣本菌株（SC401、SC417 以及WX410）的親緣關(guān)系相對(duì)于其他菌株更為接近。該結(jié)果與Marques 等[45]對(duì)18 個(gè)家庭的人和伴侶動(dòng)物的糞便分離的肺炎克雷伯菌的進(jìn)化分析結(jié)果相似：從同一環(huán)境的人和伴侶動(dòng)物的糞便分離的肺炎克雷伯菌親緣關(guān)系較近，且攜帶的毒力因子相似。

圖4 161 株ST37 型肺炎克雷伯菌進(jìn)化關(guān)系及毒力因子分布圖Fig.4 Evolution relationship and virulence factors profiles of 161 Klebsiella pneumoniae isolates

3 結(jié)論

本研究對(duì)1 株多重耐藥豬源ST37 型肺炎克雷伯菌KP200 和160 株ST37 型肺炎克雷伯菌進(jìn)行毒力因子比較分析，以及探討ST37 型肺炎克雷伯菌的毒力與遺傳進(jìn)化關(guān)系。毒力因子分析表明，肺炎克雷伯菌KP200 攜帶7 類毒力因子，毒力因子種類較多，具有潛在的致病性。進(jìn)一步對(duì)161 株ST37 型肺炎克雷伯菌毒力基因型與進(jìn)化關(guān)系之間的分析發(fā)現(xiàn)，所有菌株都攜帶多種類型的毒力因子，毒力因子分布具有差異性，且親緣關(guān)系較近的菌株其毒力基因型較為相似。本研究在豬源肺炎克雷伯菌的毒力及進(jìn)化研究中具有一定的意義。