趙國旺 齊家龍 付 萍

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，昆明 650101）

抗Ro52抗體是干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）的特異性自身抗體，發(fā)生率約為66.7%，其與口眼干燥癥及淋巴瘤呈正性相關(guān)；然而抗Ro52抗體在其他自身免疫性疾病中也常有表達(dá)，如：約有30%系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者表達(dá)抗Ro52抗體，這一抗體與狼瘡患者的皮膚光敏密切相關(guān)［1］；約有20%特發(fā)性炎癥性肌?。╥diopathic inflammatory myopathies，IIM）患者表達(dá)抗Ro52抗體，并且約有14%的免疫性肌炎中可以單獨(dú)檢測(cè)到抗Ro52抗體［2-3］，抗Jo-1抗體陽性的肌炎患者中抗Ro52 抗體同時(shí)出現(xiàn)的概率約為70%。與單獨(dú)的抗Jo-1抗體陽性的患者相比，同時(shí)表達(dá)抗Ro52抗體和抗Jo-1 抗體的患者的肌炎和關(guān)節(jié)癥狀更重，預(yù)后不良的肺間質(zhì)纖維化和腫瘤的發(fā)生率更高［4］。而且IgM 型抗磷脂?？贵w可以降低SLE 活動(dòng)度及減少器官損害，IgM 型抗ds-DNA 抗體可以降低SLE 患者腎損害的發(fā)病率，同時(shí)對(duì)狼瘡鼠也具有治療作用［5］。另外，以細(xì)胞凋亡相關(guān)抗原為靶抗原的IgM 型自身抗體對(duì)SLE 患者也具有保護(hù)作用，其與疾病的活動(dòng)性、器官損害及心血管事件發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)［6］。IgA、IgE 和大多數(shù)IgG 型自身抗體參與疾病的發(fā)病機(jī)制，其中IgA和IgE型自身抗體可能參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病及進(jìn)展［7-8］；研究表明母親抗Ro52 抗體的IgG型與新生兒狼瘡的房室傳導(dǎo)阻滯密切相關(guān)［9］。所以本研究旨在研究不同抗Ro52 抗體亞型與不同臨床表現(xiàn)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本收集 收集2015年1月至2017年10月于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科明確診斷為SLE/SS/IIM 且抗Ro52 抗體陽性的住院患者1 ml血清標(biāo)本和病例各50/30/30 份作為實(shí)驗(yàn)組；及明確診斷為SLE/IIM 且抗Ro52 抗體陰性的住院患者病例分別50/30 份，作為對(duì)照組。所有入組患者分別符合2012 年國際狼瘡研究臨床協(xié)作組制定的SLE 分類標(biāo)準(zhǔn)、2016 年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的pSS 分類標(biāo)準(zhǔn)、2017 年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟/美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于成人IIM的分類標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要材料 pThioHISA 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，大腸桿菌BL21、ER2566 由本實(shí)驗(yàn)室保存，TRIM21 基因（Cat.No：SM0331）由上海生工生物公司優(yōu)化并合成。Anti-TRIM21 抗體、山羊Anti-Human IgG/A/M H&L（HRP）購自Abcam 公司，KOD DNA 聚合酶購自ToYoBo 公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒小提試劑盒云南杰美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組pThioHISA-TRIM21 質(zhì)粒的構(gòu)建TRIM21 全基因由生工生物工程（上海）股份有限公司優(yōu)化并合成，得到含有目的基因的重組質(zhì)粒pUC57-TRIM21。以質(zhì)粒pUC57-TRIM21 為模板，設(shè)計(jì)分別帶有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅠ位點(diǎn)的上下游引物（上游：5'-TTTAACGGCACACTTGAC-3'；下游：5'-CTAGAGATGGAGAGGAGA-3'）。通過分子克隆方法將目的基因插入表達(dá)載體pThioHISA 中，構(gòu)建pThioHISA-TRIM21質(zhì)粒。

1.2.2 重組TRIM21 的表達(dá)與純化 取-20℃保存菌液10 μl 于5 ml LB 培養(yǎng)基內(nèi)活化，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)8～12 h。將活化的菌液加入無菌的LB 培養(yǎng)基內(nèi)，并加入氨芐青霉素；將培養(yǎng)基置于37℃大搖床內(nèi)，180 r/min 振蕩培養(yǎng)6～8 h，去除少量菌液測(cè)定OD600在0.6 左右時(shí)，降低溫度培養(yǎng)。搖瓶內(nèi)菌液的溫度降至誘導(dǎo)溫度時(shí)，按照1∶1 000 比例加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)8～10 h?；厥站w，8 000 g離心15 min，去除菌液上清。超聲裂解破碎菌體重懸液，分別取適量上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析及Western blot驗(yàn)證。將可溶性蛋白通過不同梯度濃度尿素進(jìn)行純化和復(fù)性。

1.2.3 Western blot 驗(yàn)證 將重組TRIM21 抗原做樣，進(jìn)行SDS-PAGE 膠分析，待樣品快跑出膠時(shí)將膠取出，浸泡在1×的電轉(zhuǎn)液里面。打開電轉(zhuǎn)儀器去離子水清洗干凈，鋪上一層大小與膠相當(dāng)，使用電轉(zhuǎn)液浸潤的濾紙，在上面鋪上一層硝酸纖維素膜，將膠平鋪在膜上，最后蓋上一層濾紙，保證每層膜之間沒有氣泡。連接電源，按照每塊膠電流為35 mA設(shè)定參數(shù)，時(shí)間為1 h。轉(zhuǎn)膜完成后，將硝酸纖維素膜取出浸泡在脫脂奶封閉液中，室溫封閉2 h。封閉完成后使用TNT（即在TN 緩沖液中加入Tween-20至0.05%）清洗1 遍，按照1∶3 000 稀釋中和 抗TRIM21單抗作為一抗，室溫孵育45 min。一抗孵育完成后，使用TNT 清洗5 遍，每遍3 min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體作為二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。酶標(biāo)二抗體孵育完成后，使用TNT清洗5遍，每遍3 min。清洗完成后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4 ELISA 實(shí)驗(yàn) 采用重組TRIM21 作為抗原，使用1*CB作為包被緩沖液，包被濃度為100 ng/孔，體積為100 μl/孔，37℃培養(yǎng)箱包被2 h 后置于4℃冷庫過夜。采用4%的明膠作為封閉液，200 μl/孔，37℃封閉2 h。使用20%NBS 為樣品稀釋液，稀釋100 倍。將稀釋好的血清100 μl/孔轉(zhuǎn)移至包被有抗原的KE 板內(nèi)，用封板膜封住，防止液體揮發(fā)及污染，并置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育45 min。揭掉封板膜后使用PBST 清洗5 遍，甩干/拍干板內(nèi)殘留液體。加入100 μl/孔酶標(biāo)二抗GAM-HRP（1∶5 000），蓋上封板膜37℃孵育1 h。揭掉封板膜后使用PBST清洗5 遍，甩干/拍干板內(nèi)殘留液體。加入顯色液（A∶B=1∶1）100 μl/孔，顯色15 min，加入終止液50 μl/孔，反應(yīng)5 min后，酶標(biāo)儀于450 nm處讀取各孔OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布均采用表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)；多組之間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM21（Ro52）表達(dá)和純化

2.1.1 TRIM21表達(dá)質(zhì)粒鑒定TRIM21，總共1 440 bp，大約50 kD，當(dāng)連接在pHisA 載體上時(shí)，總共大約66 kD。pThioHISA-TRIM21 質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切后可見大小約1 440 bp 的目的條帶，與理論的條帶位置大小相同。經(jīng)PCR 鑒定及合成的TRIM21基因（由公司合成Puc57-TRIM21）作為對(duì)照，顯示目的基因片段已經(jīng)正確插入表達(dá)載體中，可進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)純化工作（圖1）。

圖1 重組pThioHISA-TRIM21質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定Fig.1 Construction and identification of recombinant pThioHISA-TRIM21 plasmid

2.1.2 TRIM21 表達(dá)與鑒定 選取鑒定正確的TRIM21 表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化ER2566 菌株及BL21 菌株，并挑選陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)結(jié)果如圖2所示。所挑選的克隆在66 kD 大小位置，相較于BL21及ER2566菌體蛋白均有明顯的目的蛋白的表達(dá)，與理論分子量相當(dāng)。

圖2 TRIM21表達(dá)與鑒定Fig.2 Expression and identification of TRIM21

2.1.3 TRIM21 蛋白純化與鑒定 對(duì)蛋白大量表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在30℃及18℃兩個(gè)溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白均是以包涵體形式存在。純化采用不同濃度的尿素吹溶后進(jìn)行梯度透析復(fù)性，即可去除大量菌體自身的蛋白。本研究采用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖3、4所示。

圖3 蛋白純化Fig.3 Purification of protein

2.1.4 TRIM21 蛋白復(fù)性及鑒定 對(duì)不同濃度尿素吹溶初步純化并鑒定好的蛋白做梯度透析復(fù)性，并對(duì)其進(jìn)行Western blot 驗(yàn)證，結(jié)果如圖5 所示。目的條帶顯色明顯且具有明顯的特異性，為接下來的間接ELISA 實(shí)驗(yàn)做好了必需的特異性TRIM21抗原。

圖4 蛋白純化與鑒定Fig.4 Purification and identification of protein

圖5 蛋白復(fù)性與鑒定Fig.5 Renaturation and identification of protein

2.2 抗Ro52抗體亞型的ELISA檢測(cè)

2.2.1 110份血清樣本中（包括SLE 50份、SS 30份、IIM 30 份），抗Ro52 抗體亞型IgG 的水平明顯高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）的水平；且IgM的水平也明顯高于IgA的水平（P＜0.000 1）。見表1。

2.2.2 ①在50 份SLE 血清中，抗Ro52 抗體亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）；而IgM 與IgA 之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.140 0）。②在30 份SS 血清中，抗Ro52 抗體亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）；而IgM與IgA之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.551 3）。③在30 份IIM 血清中，抗Ro52 抗體亞型IgA 水平低于IgG（P=0.000 2）和IgM（P＜0.000 1）；而IgG 與IgM 之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.061 0）。見表1。

表1 ELISA測(cè)定中各組分IgG/ IgM/ IgA的OD值（）Tab.1 OD value of IgG/ IgM/ IgA of each component was determined by ELISA（）

表1 ELISA測(cè)定中各組分IgG/ IgM/ IgA的OD值（）Tab.1 OD value of IgG/ IgM/ IgA of each component was determined by ELISA（）

2.3 病例統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3.1 ①在50 份被檢測(cè)的抗Ro52 抗體陽性的SLE患者中抗Ro52抗體陽性患者的狼瘡活動(dòng)度評(píng)分（systemic lupus erythematosus activity indexes，SLEDAI）在IgG型與非IgG型（即IgM和IgA）中無明顯差異（采用t檢驗(yàn)，P=0.337 6）。狼瘡性腎炎（lupus nepphritis，LN）（P=0.560 2）、血小板（platelet，PLT）降低（P=0.252 0）、皮疹的發(fā)生率（P=0.568 3）在IgG型與非IgG型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而IgG型患者關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率低于非IgG 型（P=0.045 1）（采用χ2檢驗(yàn)）。②50 份抗Ro52 抗體陽性與50 份抗Ro52 抗體陰性的SLE 患者中SLEDAI 評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（采用t檢驗(yàn)，P=0.219 7）。LN（P=0.836 9）、PLT降低（P=0.689 3）、皮疹的發(fā)生率（P＞0.999 9）無明顯差異，而抗Ro52抗體陽性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率高于陰性患者（P=0.001 8）（采用χ2檢驗(yàn)）。見表2。

表2 anti-Ro52（+）/（-）SLE（各50份）相關(guān)指標(biāo)的差異Tab.2 Differences in related indicators of anti-RO52（+）/（-）SLE（50 copies each）

2.3.2 在30 份被檢測(cè)的抗Ro52 抗體陽性的SS 患者中干燥綜合征疾病活動(dòng)度評(píng)分（EULAR primary Sj?gren's syndrome disease activity indexes，ESSDAI）在IgG 型與非IgG 型抗Ro52抗體陽性患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（采用t檢驗(yàn)，P=0.144 7）。IgG 升高（P=0.418 9）、肺間質(zhì)病變（interstitial lung disease，ILD）（P=0.670 7）的發(fā)生率在IgG型與非IgG型患者之間無明顯差異（采用χ2檢驗(yàn)）。

2.3.3 ①在30 份被檢測(cè)的抗Ro52 抗體陽性的IIM患者中肌炎活動(dòng)度（myositis activity indexes，MDI）（P=0.170 3）、肌炎皮損嚴(yán)重指數(shù)（cutaneous dermatomyositis disease area and severity index，CDASI）（活動(dòng)性）（P=0.667 8）、CDASI（損傷性）（P=0.446 4）在IgG 型與非IgG 型抗Ro52 抗體患者中無明顯差異（采用t檢驗(yàn)）；而IgG 型患者ILD 的發(fā)生率較高（采用χ2檢驗(yàn)，P=0.026 1）。②在30 份抗Ro52 抗體陽性與30 份抗Ro52 抗體陰性IIM 患者中抗Ro52 抗體陽性患者M(jìn)DI 高于陰性患者（P=0.007 7），CDASI（活動(dòng)性）（P=0.055 1）、CDASI（損傷性）（P=0.540 8）在二者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（采用t檢驗(yàn)）；而抗Ro52 抗體陽性患者ILD 的發(fā)生率高于陰性患者（采用χ2檢驗(yàn)，P=0.022 1）。

3 討論

本研究通過納入110 例抗Ro52 抗體陽性患者血清樣本（包括SLE 50 份、SS 30 份、IIM 30 份）及190 份病歷資料（包括SLE Ro52+/-各50 份、SS Ro52+30 份、IIM Ro52+/-各30 份）。旨在研究不同臨床表現(xiàn)與抗Ro52 抗體的表達(dá)及該抗體亞型之間的相關(guān)性。在110 份總樣本中，抗Ro52 抗體亞型IgG的水平明顯高于IgM和IgA的水平（P＜0.000 1）；而且在50 份SLE 樣本中，亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）、IgA（P＜0.000 1）；30 份SS 中，亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）；30 份IIM 中，亞型IgA 水平低于IgG（P=0.000 2）和IgM（P＜0.000 1）；而IgG 與IgM 之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.061 0）。結(jié)果表明不管在總樣本中還是不同病種中，抗Ro52 抗體亞型都是以IgG 為主。研究表明母親抗Ro52 抗體的IgG 型與新生兒狼瘡的房室傳導(dǎo)阻滯密切相關(guān)［9］，該抗體IgG 型主要抗Ro52 蛋白的氨基酸序列200～239，而此序列正位于Ro52 蛋白卷曲結(jié)構(gòu)域中［10］，也許表明該結(jié)構(gòu)域是Ro52蛋白的主要抗原表位。然而目前研究僅表明此結(jié)構(gòu)域與Ro52蛋白細(xì)胞質(zhì)定位密切相關(guān)，所以還需進(jìn)一步針對(duì)該蛋白不同結(jié)構(gòu)域的功能進(jìn)行研究。

本研究中還有一有趣發(fā)現(xiàn)，即在SLE 患者中抗Ro52 抗體陽性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率高于陰性患者（P=0.001 8）（采用χ2檢驗(yàn)），且IgG型患者關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率低于非IgG 型（P=0.045 1）（采用χ2檢驗(yàn)）；有研究表明IIM 患者中，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率與抗Ro52 抗體正相關(guān)［11］。在IIM 患者中抗Ro52抗體陽性患者ILD的發(fā)生率較高（采用χ2檢驗(yàn)，P=0.022 1），這與SRIVASTAVA 等［11］研究結(jié)果一致。且本研究還發(fā)現(xiàn)IgG型患者ILD 的發(fā)生率高（采用χ2檢驗(yàn)，P=0.026 1）。而在SS 中，ILD 的發(fā)生率與抗Ro52 抗體的亞型無關(guān)，且CLANCY 等［12］和MIRANDA 等［13］研究表明：SS患者中，ILD 與抗Ro52 抗體不相關(guān)；再者，本研究中SS 患者中的抗Ro52 抗體亞型主要是以IgG 型為主。另外，本研究中抗Ro52抗體陽性SLE 患者的白細(xì)胞減少發(fā)生率較陰性者高（與MENOR［14］和BROUWER等［15］研究結(jié)果一致）；抗Ro52 抗體陽性IIM 患者的MDI評(píng)分較陰性者高；但都與該抗體亞型沒有關(guān)聯(lián)。所以這些結(jié)果似乎表明抗Ro52 抗體在不同疾病中具有不同的致病性，即使同一亞型（如IgG 型）在不同的疾病內(nèi)環(huán)境下也能導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)；如前所述該抗體IgG 型靶抗原表位主要是位于Ro52 蛋白卷曲結(jié)構(gòu)域中，所以不同疾病自身炎癥環(huán)境和基因背景可能是導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵因素。但是至今為止，對(duì)即使在同一疾病中抗Ro52抗體的致病機(jī)制都知之甚少。其是否是通過作用于靶蛋白R(shí)o52 而介導(dǎo)致?。磕壳盀橹怪挥畜w外研究顯示抗Ro52 抗體能夠結(jié)合Ro52 的RING 結(jié)構(gòu)域從而抑制Ro52介導(dǎo)的泛素化而積極地參與自身免疫疾?。?6］；還是直接致?。坑醒芯勘砻骺筊o52 抗體能直接結(jié)合心肌細(xì)胞，導(dǎo)致胎兒房室結(jié)傳導(dǎo)時(shí)間的延長，導(dǎo)致患兒先天性心臟傳導(dǎo)阻滯［17］；還是通過IC 形式參與致??？IC 能被漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞吞噬轉(zhuǎn)位到核內(nèi)體并刺激TLR7 或TLR9 活化，導(dǎo)致IFN-α 的大量釋放；還是與其相關(guān)多重機(jī)制共同介導(dǎo)？如本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，相關(guān)臨床表現(xiàn)不僅與抗Ro52抗體相關(guān)，還與該抗體的亞型有關(guān)。所以也許抗Ro52抗體不同亞型所針對(duì)不同Ro52 蛋白結(jié)構(gòu)域在不同疾病中所導(dǎo)致的致病機(jī)制也不盡相同。但由于本實(shí)驗(yàn)樣本量有限未能統(tǒng)計(jì)出更多的臨床表現(xiàn)與抗Ro52抗體亞型的相關(guān)性，故在后續(xù)研究中加大樣本量至關(guān)重要，這樣才能繼續(xù)深入研究該抗體的亞型與更多的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的相關(guān)性，使其亞型成為臨床預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)，從而為該抗體致病性的基礎(chǔ)研究做好鋪墊。