朱 瑩 陳敏鎵 李瑋瑋

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院病理科，東莞 523059）

胸腺上皮腫瘤（thymic epithelial tumors，TETs）是最常見的前縱隔腫瘤，但也是成人罕見的惡性腫瘤之一，包括胸腺瘤和胸腺癌（又稱C 型胸腺瘤）［1］。2015 版WHO 已將胸腺瘤更新為惡性腫瘤，其預(yù)后主要參考腫瘤分期、手術(shù)切除是否徹底及病理組織學(xué)的診斷（A 型、AB 型、B1 型、B2 型、B3 型預(yù)后依次變差），晚期患者的五年生存率為69%［1-2］。胸腺癌發(fā)病率低，但其臨床侵襲性較胸腺瘤更強(qiáng)，晚期病人五年生存率僅為36%［1］。目前臨床缺乏有效的協(xié)助TETs臨床診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。

IL-15作為一種多效促炎癥因子，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性，參與自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的發(fā)育、增殖和存活［3-5］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-15 通過刺激免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)多種免疫器官或免疫細(xì)胞相關(guān)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，如多發(fā)性骨髓瘤、皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤、大顆粒淋巴細(xì)胞白血病和B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病等［6-9］。而IL-15 作為一種與免疫器官（細(xì)胞）腫瘤密切相關(guān)的細(xì)胞因子，其在TETs 中的研究十分有限。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法和腫瘤組織標(biāo)本檢測，綜合分析IL-15 在TETs 組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為TETs的診斷和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步探究TETs中IL-15參與的生物學(xué)功能、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白-蛋白相互作用，為TETs的發(fā)病機(jī)制提供線索和思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 患者一般資料 回顧性收集2014 年至2018年于東莞市人民醫(yī)院手術(shù)切除的38例TETs 標(biāo)本及病歷資料（其中A 型胸腺瘤4 例，AB 型胸腺瘤8例，B1型胸腺瘤3例，B2型胸腺瘤18例，B3型胸腺瘤5 例），患者年齡19～74 歲，中位年齡48 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)影像學(xué)、病理學(xué)等手段確診；入組前未行放化療及其他免疫治療；患者或親屬簽署知情同意書，并上報(bào)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人IL-15 單克隆抗體（ab55276，Abcam）；IgG 羊抗鼠二抗、免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）檢測TETs 組織中IL-15蛋白表達(dá) 采用鼠抗人IL-15單克隆抗體、IgG羊抗鼠二抗以及免疫組織化學(xué)試劑盒，根據(jù)試劑盒說明對石蠟切片進(jìn)行IHC染色。

評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色組織的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評分。①按染色強(qiáng)度評分：不著色評為0分，淡黃色評為1分，黃褐色評為2分，棕褐色評為3 分。②根據(jù)陽性細(xì)胞百分率評分：陽性比例≤5%評為1分，5%＜陽性比例≤25%評為2分，25%＜陽性比例≤50%評為3 分，50%＜陽性比例≤100%評為4分。免疫組織化學(xué)染色評分為以上2個(gè)評分相乘，0～4 分為低表達(dá)，5～12 分為高表達(dá)。陽性率按陽性例數(shù)除以總例數(shù)計(jì)算。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法分別觀察切片，若觀察結(jié)果相差3 分，則重新評定。

1.2.2 數(shù)據(jù)來源 數(shù)據(jù)源于TCGA（http：//cancergenome.nih.gov/）腫瘤數(shù)據(jù)庫中2018 年胸腺上皮腫瘤IL-15的mRNA seq表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床資料123例（Thymoma，TCGA，PanCancer Altas，2018）。將IL-15 mRNA 數(shù)據(jù)與其他臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)合并，刪除無預(yù)后信息、術(shù)前接受輔助治療、微結(jié)節(jié)型胸腺瘤的患者，最終得到115 例患者數(shù)據(jù)［10］。數(shù)據(jù)說明：在TCGA數(shù)據(jù)庫中，胸腺瘤（thymoma，THYM）數(shù)據(jù)包含10 例胸腺癌數(shù)據(jù)，本文中統(tǒng)一注釋為TETs進(jìn)行分析。

1.2.3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA2（gene expression profiling interactive analysis 2）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn）由北京大學(xué)研發(fā)，用于結(jié)合分析TCGA 和GTEx（genotype-tissues expression）數(shù)據(jù)庫中基因在不同腫瘤和正常樣本中的mRNA 表達(dá)情況［11］。用于分析在TETs 組織和正常胸腺組織中IL-15的表達(dá)。

1.2.4 IL-15共表達(dá)基因的獲得與富集分析 利用cBioPortal在線分析平臺［12］（https：//www.cbioportal.org/）進(jìn)一步深入挖掘TCGA TETs 數(shù)據(jù)信息，獲得IL-15 共表達(dá)基因，設(shè)置Spearman 相關(guān)系數(shù)|R|≥0.4。采用DAVID［13］（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行IL-15 共表達(dá)基因GO（gene ontology）功能分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of gene and genomes）信號通路的富集分析。P-value＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 STRING 數(shù)據(jù)庫［14］（https：//string-db.org/）基于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、基因鄰近、共表達(dá)、同源推測等認(rèn)證提供基因或蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系。本文利用STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測并構(gòu)建人類樣本中IL-15 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置置信度0.7，最大相互作用基因數(shù)10，并在線進(jìn)行GO 和KEGG分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)分析IL-15 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。Log-rank 檢驗(yàn)構(gòu)建Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行總體生存（overall survival，OS）及無進(jìn)展生存（progress free survival，PFS）分析。利用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對IL-15 及臨床病理特征進(jìn)行多因素分析。GraphPad Prism 8 軟件繪圖，計(jì)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，兩組計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用Student'st檢驗(yàn)（t-test）。P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-15 在胸腺上皮腫瘤組織中高表達(dá) GEPIA網(wǎng)站綜合分析TCGA 數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示，與對應(yīng)正常組織相比，IL-15 mRNA 在胸腺上皮腫瘤（thymoma，THYM）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、卵巢漿液性癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）中表達(dá)升高（圖1）。其中，118 例TETs 組織中IL-15 mRNA 表達(dá)高于339 例正常胸腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2A）。同時(shí)，IHC 結(jié)果顯示，IL-15 蛋白表達(dá)定位于胸腺上皮細(xì)胞核，IL-15在38 例TETs 組織中表達(dá)高于10 例正常胸腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）。

圖1 IL-15在不同腫瘤組織和對應(yīng)的正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-15 in different tumor tissues and corresponding normal tissues

圖2 IL-15在TETs組織中高表達(dá)Fig.2 IL-15 was overexpressed in TETs tissues

2.2 TETs 中IL-15 表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中115 例TETs 組織中IL-15 mRNA 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL-15 表達(dá)與患者的組織學(xué)分型診斷及是否伴有重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）相關(guān)（P＜0.01）。即IL-15 高表達(dá)見于12.07%（7/58）的A 型及AB 型胸腺瘤組，而B 型及C 型胸腺瘤組IL-15 高表達(dá)約占33.33%（19/57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TETs 不伴MG（TETs/MG-）的患者IL-15 高表達(dá)約占13.41%（11/82），TETs 伴MG（TETs/MG+）的組患者IL-15高表達(dá)約占46.88%（15/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。IL-15的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤Masaoka-Koga分期、淋巴細(xì)胞分級無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色檢測TETs 組織標(biāo)本中IL-15蛋白表達(dá)情況（圖3）。結(jié)果顯示，IL-15蛋白低表達(dá)組織占65.79%（1～4 分，25/38），IL-15蛋白高表達(dá)組織占34.21%（5～12分，13/38）。IL-15蛋白表達(dá)與淋巴細(xì)胞分級和患者是否伴有重癥肌無力有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤Masaoka-Koga 分期和組織學(xué)分型診斷無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 TETs中IL-15表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Association between IL-15 expression and clinical pathology parameters in TETs

圖3 TETs組織中IL-15的表達(dá)（IHC，×200）Fig.3 Expression of IL-15 in TETs（IHC，×200）

2.3 IL-15 表達(dá)水平與TETs 患者預(yù)后的關(guān)系 運(yùn)用Kaplan-Meier 曲線法分析TETs（TCGA，PanCancer Altas，2018，n=115），結(jié)果顯示IL-15高表達(dá)患者OS（HR=31.996，95%CI：3.915～261.473，P＜0.001，圖4A）和PFS（HR=5.6，95%CI：2.241～13.991，P＜0.001，圖4B）顯著縮短，預(yù)后差。Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)，IL-15 可作為TETs 患者OS（HR=27.047，95%CI：3.174～230.452，P=0.003，表2）及PFS（HR=7.734，95%CI：2.882～20.753，P＜0.001，表3）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 TETs患者總預(yù)后的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognostic factors for OS in TETs patients

表3 TETs患者無進(jìn)展預(yù)后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of prognostic factors for PFS in TETs patients

圖4 IL-15表達(dá)與TETs患者預(yù)后密切相關(guān)Fig.4 IL-15 expression was closely associated with prognosis of TETs patients

2.4 TETs 中IL-15 共表達(dá)基因富集分析和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測 cBioPortal 在線分析TCGA 胸腺上皮腫瘤數(shù)據(jù)IL-15 共表達(dá)基因，獲得256 個(gè)基因，其中正相關(guān)表達(dá)基因225個(gè)，負(fù)相關(guān)表達(dá)基因31個(gè)。隨后利用DAVID 進(jìn)行IL-15 共表達(dá)基因GO 功能分析和KEGG 通路富集分析。GO 結(jié)果顯示，IL-15 共表達(dá)基因主要富集于免疫應(yīng)答生物過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的細(xì)胞組成成分、多肽抗原結(jié)合分子功能和INF-γ 信號相關(guān)的生物學(xué)過程（圖5A）。KEGG 結(jié)果顯示，IL-15 共表達(dá)基因富集于抗原加工遞呈、細(xì)胞因子與受體相互作用、細(xì)胞黏附分子（膜型免疫分子）、TNF信號通路等（圖5B）。

圖5 TETs中IL-15共表達(dá)基因GO和KEGG通路富集分析Fig.5 GO and KEGG pathway analysis of IL-15 co-expressed genes in TETs

同時(shí)，利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建IL-15 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，PPI 網(wǎng)絡(luò)中與IL-15 相互作用的蛋白有IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL-15RA、IL-2、STAT3、STAT5A、STAT5B、JAK1、JAK3，與IL-15 蛋白結(jié)合分?jǐn)?shù)均大于0.9，PPI 富集P＜1.0e-16（圖6）。STRING數(shù)據(jù)庫在線GO分析結(jié)果表明，IL-15及其互作蛋白富集于IL-15、IL-2 等細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、蛋白磷酸化等生物學(xué)功能。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，互作蛋白顯著富集于JAK-STAT 信號通路中。

圖6 STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測IL-15相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Network of interaction protein with IL-15 using STRING database

3 討論

胸腺作為重要的中樞免疫器官，可通過胸腺上皮細(xì)胞及其他基質(zhì)細(xì)胞分泌胸腺激素和細(xì)胞因子誘導(dǎo)和決定T 淋巴細(xì)胞的分化、增殖和選擇性發(fā)育［15］。發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的胸腺可誘導(dǎo)成熟的T 細(xì)胞，導(dǎo)致胸腺免疫微環(huán)境紊亂和嚴(yán)重的免疫調(diào)節(jié)功能障礙［16］。因此，識別和探討TETs免疫相關(guān)的分子標(biāo)志物對其診斷和治療有重要的意義。

越來越多研究顯示，在免疫器官或免疫細(xì)胞相關(guān)的腫瘤中，IL-15 異常表達(dá)，并通過自分泌或旁分泌方式促進(jìn)腫瘤相關(guān)信號通路和腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)特性［17］。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞自分泌產(chǎn)生的IL-15可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，降低抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡能力［6］。皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）中顯示出IL-15 異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即IL-15 過度表達(dá)驅(qū)動(dòng)HDAC1 和HDAC6 上調(diào)，并激活致癌性miR-21 轉(zhuǎn)錄上調(diào)促進(jìn)腫瘤發(fā)生［7］。同時(shí)，利用IL-15的轉(zhuǎn)基因小鼠模型模仿證明IL-15 過表達(dá)誘導(dǎo)人類自發(fā)CTCL［7］。IL-15 是大顆粒淋巴細(xì)胞（LGLs）白血病中升高的促炎細(xì)胞因子，其異常表達(dá)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性和DNA 超甲基化［8］。同樣，在B 細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病（B-CLL）中，TLR-9 配體（ODN）與IL-15 協(xié)同作用促進(jìn)B-CLL 克隆擴(kuò)增［18］。且IL-15 在ODN 啟動(dòng)的B-CLL 中激活PI3K/AKT 和JAK/STAT5 途徑，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)周期蛋白D2（CCND2）表達(dá)，并減弱DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)變［9］。SHI等［19］研究發(fā)現(xiàn)胸腺瘤患者血清中IL-15 蛋白水平顯著高于健康人。本文研究發(fā)現(xiàn)IL-15 表達(dá)定位于胸腺上皮細(xì)胞，且在TETs 組織中高表達(dá)，并隨著病理組織學(xué)分級升級而表達(dá)升高。同時(shí)，IL-15高表達(dá)患者OS和PFS顯著縮短，并可作為獨(dú)立預(yù)后因子。上述研究提示，長期IL-15 異常表達(dá)可能促進(jìn)胸腺免疫微環(huán)境的惡性轉(zhuǎn)變，可作為TETs診斷和不良預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

約30%～40%胸腺瘤患者伴隨著自身免疫疾病，尤其是胸腺瘤相關(guān)的重癥肌無力（TAMG）［10］。研究結(jié)果顯示，MG 患者或MG 小鼠的血清IL-15 蛋白表達(dá)顯著高于正常組［19-20］，且IL-15 在胸腺瘤伴有MG 患者、無胸腺瘤的MG 患者和健康人血清中發(fā)生顯著變化，IL-15 可能在MG 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用［20］。本文基于TCGA 數(shù)據(jù)和病人標(biāo)本IHC 檢測發(fā)現(xiàn)，TETs 細(xì)胞中IL-15 表達(dá)與TETs 患者是否伴有MG 相關(guān)，即TETs 伴隨MG 的患者IL-15 表達(dá)水平高于不伴MG 的患者。上述結(jié)果提示TETs 相關(guān)的MG可能與IL-15高表達(dá)有關(guān)。IL-15異常表達(dá)可能導(dǎo)致TETs 中AChR 自身耐受和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的破壞，促進(jìn)MG 的發(fā)生和進(jìn)展，但具體致病機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

大量研究發(fā)現(xiàn)，IL-15主要通過與受體結(jié)合激活胞內(nèi)JAK/STAT 信號通路、Ras/MAPK 信號通路、PI3K/AKT 信號通路，發(fā)揮促進(jìn)靶細(xì)胞增殖活化，減弱凋亡信號，IFN-γ、TNF-α 分泌增強(qiáng)等生物學(xué)功能［17］。本文通過STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示IL-15互作蛋白主要參與IL-15 受體介導(dǎo)的JAK/STAT 信號通路。同時(shí)，TETs 中IL-15 共表達(dá)基因富集分析結(jié)果顯示，這些基因主要富集于免疫分子、免疫細(xì)胞等介導(dǎo)的免疫相關(guān)的生物學(xué)功能和信號通路，如免疫應(yīng)答過程、多肽抗原結(jié)合分子功能、INF-γ 介導(dǎo)的信號通路、抗原加工遞呈、TNF信號通路等。提示在TETs 免疫微環(huán)境中，IL-15 可能促進(jìn)活化腫瘤相關(guān)信號通路，導(dǎo)致胸腺上皮細(xì)胞的惡性增殖。

綜上所述，本文依據(jù)生物信息學(xué)和病人組織標(biāo)本檢測分析IL-15與TETs發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步通過生物功能和信號通路富集結(jié)果探討其分子機(jī)制。我們認(rèn)為在TETs 中，IL-15 可能通過TETs細(xì)胞的自分泌或旁分泌途徑，活化腫瘤相關(guān)信號通路，導(dǎo)致免疫微環(huán)境異常、免疫功能失調(diào)，促進(jìn)TETs細(xì)胞增殖，并引起TETs相關(guān)的MG 發(fā)生。這些認(rèn)識和發(fā)現(xiàn)將為臨床TETs患者的管理提供參考，也為后續(xù)深入開展臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)和方向。