CREB1基因與抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙的關(guān)聯(lián)研究

施 波，陳建民，趙俊雄，唐 偉，范衛(wèi)星，張程赪，張 晨

1.浙江省金華市第二醫(yī)院精神科，金華 321016；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬康寧醫(yī)院精神科，溫州 325000；3.廣東省韶關(guān)市粵北第三人民醫(yī)院精神科，韶關(guān) 512200；4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心心境障礙科，上海 200030

抑郁發(fā)作是一種常見的心境障礙性疾病，以顯著的情緒低落、興趣減退、認(rèn)知功能受損為主要特征，嚴(yán)重者可出現(xiàn)消極觀念和行為［1］。抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙是常見的抑郁發(fā)作類型；抑郁癥指曾出現(xiàn)多次抑郁發(fā)作而無躁狂發(fā)作，雙相Ⅱ型障礙指包含一次或以上重性抑郁發(fā)作以及至少一次輕躁狂發(fā)作的雙相障礙（不能有躁狂發(fā)作或混合發(fā)作）［2］。在實(shí)際臨床工作中，抑郁癥、雙相Ⅱ型障礙常因抑郁發(fā)作階段癥狀相似而難以鑒別，甚至有雙相Ⅱ型障礙患者在癥狀出現(xiàn)多年后確診，對臨床診斷和治療造成極大的影響，給患者生命安全也帶來潛在隱患。目前抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙診斷仍依據(jù)臨床癥狀學(xué)識別，無客觀指標(biāo)的支持，導(dǎo)致誤診率和漏診率較高，因此探索可靠有效的生物標(biāo)志物以提高抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙鑒別的準(zhǔn)確性及指導(dǎo)治療策略已成為當(dāng)前精神醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)?；谝钟舭Y和雙相Ⅱ型障礙的治療方案和預(yù)后差異，目前認(rèn)為兩者間可能存在不同的發(fā)病機(jī)制，屬于不同的疾病譜系［3］。本課題組在前期研究［4］中發(fā)現(xiàn)環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP responsive elementbinding 1，CREB1）基因在抑郁癥和雙相障礙患者腦內(nèi)的表達(dá)存在差異，提示CREB1基因可能具有鑒別抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙的潛在價值。因此，本研究旨在探討CREB1基因與抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2015年1月—2018年12月在浙江省金華市第二醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬康寧醫(yī)院、廣東省韶關(guān)市粵北第三人民醫(yī)院和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心住院部及門診治療的抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國精神病協(xié)會《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊（第4版）》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fourth edition，DSM-Ⅳ）中抑郁癥或雙相Ⅱ型障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)。②漢密爾頓抑郁量表（Hamilton Depression Rating Scale，HAMD）評分≥17分。③抑郁癥患者輕躁狂癥狀清單（Hypomania Check List-32，HCL-32）篩查陰性，雙相Ⅱ型障礙患者HCL-32篩查陽性。④年齡18～45歲。⑤能夠理解和遵守研究要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有躁狂發(fā)作史。②腦器質(zhì)性精神障礙。③精神活性物質(zhì)或非成癮物質(zhì)所致精神障礙。④患有嚴(yán)重的軀體疾病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近期外傷或近1周內(nèi)有感染或發(fā)熱者。⑤溝通困難者或不合作者。選取同期在上海市徐匯區(qū)龍華街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心參加體檢的健康志愿者（無中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及各種軀體疾病史、精神疾病史和精神疾病家族史）。本研究經(jīng)浙江省金華市第二醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（審批號：2018-01-02），所有入組對象均簽署知情同意書。

本研究共納入抑郁癥患者362例，平均年齡（34.0±8.7 ）歲，男性1 6 3例、女性1 9 9例，受教育年限（1 2.7 ±1.8 ）年，首發(fā)年齡（28.4 ±4.7 ）歲，病程（36.2 ±14.9 ）個月；雙相Ⅱ型障礙組患者381例，平均年齡（33.5 ±7.4 ）歲，男性174例、女性207例，受教育年限（12.1 ±2.2 ）年，首發(fā)年齡（25.8 ±7.7 ）歲，病程（32.1 ±12.9 ）個月；對照組共納入健康志愿者416例，平均年齡（35.1 ±7.4 ）歲，男性187例、女性229例，受教育年限（11.9 ±1.4 ）年。抑郁癥組、雙相Ⅱ型障礙組分別與健康對照組比較，性別（χ2=0.01 ，P=0.958 ；χ2=0.04 ，P=0.831 ）、年齡（t=-1.13 ，P=0.258 ；t=-0.22 ，P=0.782 ）及受教育年限（t=0.64 ，P=0.517 ；t=0.11 ，P=0.912 ）間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 DNA提取和位點(diǎn)選擇

采集每位入組對象的靜脈血2m L，乙二胺四乙酸抗凝備用，采用離心柱型基因組DNA試劑盒（DP304型，北京天根生物有限公司）提取外周血白細(xì)胞全基因組DNA。CREB1基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）選擇參考本課題組前期工作［5］，簡述如下：根據(jù)HapMap基因型數(shù)據(jù)庫中的中國北京漢族人群數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP標(biāo)簽選擇；根據(jù)條件決定系數(shù)r2＞0.8 ，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞20%，篩 選 得 到2個SNP標(biāo) 簽rs10932201和rs3770704；采用單堿基延伸法（SNaPshot）SNP分型技術(shù)對rs10932201和rs3770704位點(diǎn)進(jìn)行分型。實(shí)驗(yàn)流程同前，所有樣本按10%比例隨機(jī)重復(fù)進(jìn)行質(zhì)量控制，結(jié)果顯示基因分型結(jié)果重復(fù)率為100%。

1.3 基因表達(dá)數(shù)量性狀分析

采用英國腦表達(dá)聯(lián)盟（United Kingdom Brain Expression Consortium，UKBEC）的公共在線數(shù)據(jù)庫BRAINEAC（http：//peana-od.inf.um.es：8080/UKBECv12/）分析SNP對腦內(nèi)CREB1基因表達(dá)數(shù)量性狀（expression quantitative trait loci，eQTL）的影響。該數(shù)據(jù)庫對10個以上的大腦腦區(qū)進(jìn)行mRNA定量，研究人腦多個區(qū)域基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和選擇性剪切。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Epidata 3.0.2 軟件建立數(shù)據(jù)庫，用雙人錄入法進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入和邏輯檢錯。使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料用x±s表示，采用t檢驗(yàn)分析進(jìn)行組間比較。定性資料以頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg吻合度檢驗(yàn)運(yùn)用在線軟件（http：//www.kursus.kvl.dk/shares/vetgen/Popgen/genetik/applets/kitest.htm）計(jì)算。Hardy-Weinberg檢驗(yàn)中P＞0.05 表示符合平衡檢驗(yàn)。采用SHEsis遺傳分析軟件進(jìn)行單位點(diǎn)遺傳關(guān)聯(lián)分析，分別比較組間各SNPs的等位基因和基因型頻率差異。使用Haploview 4.1 軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，并構(gòu)建單倍型，用r2值衡量各SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡程度。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡和連鎖不平衡檢驗(yàn)

抑郁癥組、雙相Ⅱ型障礙組與對照組CREB1基因rs10932201和rs3770704位點(diǎn)基因型的觀察值和期望值Hardy-Weinberg平衡吻合度均良好（P＞0.05），表明本研究收集到的樣本來自大的群體，個體間隨機(jī)分配，不存在明顯自然選擇、遷移等因素對遺傳平衡的影響，具有群體代表性。連鎖不平衡分析結(jié)果顯示rs10932201和rs3770704位點(diǎn)之間具有較強(qiáng)的連鎖不平衡（r2＞0.4 ），且位于同一區(qū)塊內(nèi)（圖1）。

圖1 抑郁癥組和雙相Ⅱ型障礙組CREB1基因標(biāo)簽SNP位點(diǎn)之間的連鎖不平衡Fig 1 Linkage disequilibrium between the tagSNPs of CREB1 gene in the depression group and bipolar disorder type Ⅱ group

2.2 抑郁癥組、雙相Ⅱ型障礙組與對照組CREB1基因rs10932201和rs3770704位點(diǎn)多態(tài)性比較

在CREB1基因rs10932201位點(diǎn)，雙相Ⅱ型障礙組與對照組等位基因分布頻率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.27 ，P=0.042 ），抑郁癥組與對照組等位基因分布頻率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑郁癥組、雙相Ⅱ型障礙組分別與對照組基因型分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。在CREB1基因rs3770704位點(diǎn)，無論是等位基因還是基因型分布頻率，抑郁癥組、雙相Ⅱ型障礙組分別與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表1 抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙組分別與對照組CREB1基因rs10932201基因型和等位基因頻率分布比較（n，%）Tab 1 Comparison of genotypic and allelic frequencies in rs10932201 loci of CREB1 gene between the depression，bipolar Ⅱ disorder and control groups，respectively（n，%）

表2 抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙組分別與對照組CREB1基因rs3770704位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較（n，%）Tab 2 Comparison of genotypic and allelic frequencies in rs3770704 loci of CREB1 gene between the depression，bipolar Ⅱ disorder and control groups，respectively（n，%）

2.3 CREB1基因rs10932201和rs3770704位點(diǎn)之間單倍型分析

表3顯 示CREB1基 因rs10932201和rs3770704位 點(diǎn)之間構(gòu)建的單倍型中，A-T單倍型在雙相Ⅱ型障礙組中分布頻率為57.5%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.07 ，P=0.044 ），其余單倍型分布頻率在抑郁癥組或雙相Ⅱ型障礙組中與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 CREB1基因rs10932201和rs3770704位點(diǎn)單倍型與抑郁癥和雙相Ⅱ型障礙的相關(guān)性Tab 3 Association of CREB1 gene rs10932201 and rs3770704 haplotypes with depression and bipolar Ⅱ disorder groups

2.4 rs10932201位點(diǎn)與腦內(nèi)CREB1基因表達(dá)的關(guān)系

eQTL分析結(jié)果顯示，rs10932201位點(diǎn)在顳葉皮層（temporal cortex，TCTX）內(nèi)與CREB1基因表達(dá)顯著相關(guān)（P=0.048）（圖2）。

圖2 rs10932201位點(diǎn)對各腦區(qū)CREB1基因表達(dá)的影響Fig 2 Effect of rs10932201 on expression of CREB1 gene in different brain regions

3 討論

既往研究［2］報道環(huán)磷酸腺苷通路、絲裂原活化蛋白激酶通路、鈣依賴蛋白激酶和葡萄糖合激酶通路3通路形成了CREB的上游通路，CREB作為這4條通路的交匯點(diǎn)調(diào)節(jié)其下游通路腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等基因的表達(dá)，影響神經(jīng)可塑性和大腦功能。CREB1基因是CREB的編碼基因，定位于染色體2q32-q34區(qū)域。前期多項(xiàng)研究［6-8］報道，CREB1基因與抑郁癥和雙相障礙有關(guān)，而且CREB1基因多態(tài)性在歐洲人群和中國漢族人群呈現(xiàn)明顯的分布差異。本課題組最近一項(xiàng)研究［4］顯示，CREB1基因mRNA表達(dá)水平在抑郁癥和雙相障礙患者中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示CREB1基因rs10932201位點(diǎn)與抑郁癥無顯著性關(guān)聯(lián)，這與之前的研究［9］結(jié)果一致，抑郁癥核心家系研究也發(fā)現(xiàn)CREB1基因rs10932201位點(diǎn)與抑郁癥無顯著性關(guān)聯(lián)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)CREB1基因rs10932201位點(diǎn)G等位基因分布頻率與雙相Ⅱ型障礙有關(guān)，提示rs10932201位點(diǎn)可能影響了雙相Ⅱ型障礙的發(fā)生風(fēng)險；單倍型分析也顯示CREB1基因rs10932201和rs3770704位點(diǎn)之間構(gòu)建的A-T單倍型僅與雙相Ⅱ型障礙具有顯著性相關(guān)；進(jìn)一步的eQTL分析顯示rs10932201位點(diǎn)多態(tài)性影響TCTX的CREB1基因mRNA表 達(dá)量，提示rs10932201位點(diǎn)多態(tài)性具有生物學(xué)功能，可能是雙相Ⅱ型障礙發(fā)生的風(fēng)險因子。

神經(jīng)影像學(xué)研究［11］顯示，未服藥的雙相抑郁患者TCTX功能明顯下降。TCTX參與多種神經(jīng)認(rèn)知加工過程，如執(zhí)行功能等［12］。既往研究［13］報道rs10932201位點(diǎn)與場景記憶和執(zhí)行功能有關(guān)，該位點(diǎn)的變異與個體認(rèn)知的水平直接相關(guān)。因此，rs10932201位點(diǎn)多態(tài)性可能通過影響TCTX中CREB1基因mRNA表達(dá)水平導(dǎo)致CREB水平變化，進(jìn)而影響下游BDNF通路。本課題組在前期研究［14］中發(fā)現(xiàn)BDNF與雙相Ⅱ型障礙有關(guān)。那么，在基因水平上CREB1基因與BDNF基因在雙相Ⅱ型障礙的發(fā)生過程中是否存在交互作用有待于進(jìn)一步的研究。

本研究存在一定局限性：首先，本研究作為遺傳學(xué)研究，樣本量較小，未來有必要擴(kuò)大樣本量開展深入研究。其次，本研究選擇的標(biāo)簽SNP最小等位基因頻率設(shè)為大于20%，難以全面覆蓋CREB1基因。綜上所述，本研究結(jié)果顯示CREB1基因rs10932201位點(diǎn)與雙相Ⅱ型障礙有關(guān)，可能是雙相Ⅱ型障礙發(fā)生的風(fēng)險因子，但與抑郁癥無關(guān)。在后續(xù)研究中我們將繼續(xù)擴(kuò)大SNP選擇范圍，尤其是稀有突變，以驗(yàn)證本研究結(jié)果，并進(jìn)一步揭示CREB1基因在雙相Ⅱ型障礙發(fā)病機(jī)制中的作用。

參·考·文·獻(xiàn)

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