莊新怡，胡嘉奕，丁璐楠，韋思明

（浙江樹人大學(xué)樹蘭國際醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015）

睪丸扭轉(zhuǎn)（testicular torsion）是一個常見的泌尿科急癥，在25 歲以下的男性中發(fā)病率為1/4000，它導(dǎo)致了睪丸缺血[1]。外科手術(shù)復(fù)位可以恢復(fù)睪丸血流，避免睪丸梗死。但是，即使成功復(fù)位，41.4%的病例仍發(fā)生了睪丸萎縮、生精功能降低[2]。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位所誘導(dǎo)的損傷是一個典型的缺血再灌注損傷。在缺血再灌注過程中，活性氧過量產(chǎn)生，在睪丸損傷中扮演著一個關(guān)鍵的角色[3-5]。過量的活性氧，包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白變性和DNA 斷裂，最終導(dǎo)致了組織損傷和細(xì)胞死亡[6]。到目前為止，對于睪丸缺血再灌注損傷缺乏手術(shù)后的臨床輔助治療。據(jù)報道，丹酚酸B擁有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗感染和抗纖維化等[7，8]。已有研究證實，丹酚酸B 能減輕心臟的缺血再灌注損傷[9]。丹酚酸B 對睪丸缺血再灌注損傷的效應(yīng)從來沒有被研究過。本研究通過建立大鼠睪丸缺血再灌注損傷模型，探索丹酚酸B 對睪丸缺血再灌注損傷的效應(yīng)及其機(jī)制，為睪丸缺血再灌注損傷的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 60 只體重在250～300 g 的成年雄性SD 大鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，丹酚酸B 和抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自于Sigma 化學(xué)公司，抗環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)控因子τ（cAMP-responsive element modulator-τ，CREMτ）抗體來自于Santa Cruz 生物技術(shù)公司，丙二醛分析試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60 只大鼠隨機(jī)分成對照組、缺血再灌注組和治療組，每組20 只。氯胺酮（50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，大鼠被固定在手術(shù)臺上，消毒鋪巾。經(jīng)左側(cè)髂腹股溝切口，取出左側(cè)睪丸。對照組大鼠以1 根11/0 無創(chuàng)傷絲線穿過睪丸白膜，然后睪丸放回陰囊，縫合皮膚切口。缺血再灌注組大鼠逆時針扭轉(zhuǎn)左側(cè)睪丸720°來誘導(dǎo)睪丸缺血，接著用11/0 絲線固定扭轉(zhuǎn)睪丸到陰囊上，維持睪丸缺血狀態(tài)。2 h 后，睪丸恢復(fù)到正常位置，誘導(dǎo)睪丸血液再灌注。睪丸仍然存活，放回陰囊。治療組接受了與缺血再灌注組同樣的外科處理，但在再灌注時，從尾靜脈注射10 mg/kg 丹酚酸B 予以治療。灌注后4 h，每組一半大鼠的雙側(cè)睪丸被切除，用以分析丙二醛水平，然后這些大鼠通過吸入二氧化碳行安樂死。灌注后3 個月，每組剩余一半大鼠的睪丸用以評估CREMτ 蛋白表達(dá)和睪丸生精功能。

1.3 睪丸組織中丙二醛測定 睪丸組織在丙二醛裂解緩沖液中攪勻，然后組織勻漿在4 ℃以5000 r/min的速度離心15 min，獲取上清液用于丙二醛的測定。用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)試驗來確定睪丸組織的丙二醛含量，操作步驟按照試劑盒生產(chǎn)廠家的說明書進(jìn)行。

1.4 CREMτ 蛋白表達(dá)的分析 參考Liu H 等[10]的方法抽提睪丸組織的蛋白。抽提的蛋白通過電泳進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上。膜上的非特異性結(jié)合位點用含5%脫脂奶粉的溶液進(jìn)行封閉，隨后濾膜在4 ℃與CREMτ 一抗、β-actin 一抗一起孵育過夜。第2 天，濾膜在室溫下與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗一起孵育1 h。然后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光探測試劑顯示膜上蛋白條帶，接著定量條帶強(qiáng)度。CREMτ 條帶與來自同一樣本的內(nèi)參照β-actin 條帶的強(qiáng)度比值作為CREMτ 蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 睪丸生精功能的測定 通過測定睪丸重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分這些指標(biāo)來評定睪丸生精功能。睪丸切下后在電子秤上稱重，然后波恩氏液固定、石蠟包埋。從石蠟塊上切下5 μm厚的薄片，脫蠟后，蘇木素-伊紅染色。從每一個切片上選取20 個圓的曲細(xì)精管，在顯微鏡下測量其直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分，然后計算其平均值。顯微鏡的目鏡上裝有測微尺，可以測量曲細(xì)精管直徑；在每一個曲細(xì)精管，從基底膜到管腔計數(shù)生精細(xì)胞層數(shù)；根據(jù)生精細(xì)胞發(fā)育成度，對精子發(fā)生做Johnsen 評分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 用GraphPad Prism 軟件（4.0 版本）來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用（）表示，使用單因素方差分析和q檢驗來比較組間數(shù)據(jù)，組內(nèi)同側(cè)和對側(cè)睪丸之間的比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組睪丸組織內(nèi)的丙二醛水平比較 缺血再灌注組同側(cè)睪丸（即左側(cè)缺血再灌注睪丸）的丙二醛水平高于對照組、治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；三組對側(cè)睪丸（即右側(cè)睪丸）的丙二醛水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組睪丸組織內(nèi)的丙二醛水平比較

2.2 各組睪丸CREMτ 蛋白表達(dá)比較 缺血再灌注組同側(cè)睪丸的CREMτ 蛋白表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸的CREMτ 蛋白表達(dá)高于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；三組間對側(cè)睪丸的CREMτ 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組睪丸CREMτ 蛋白表達(dá)比較

2.3 各組睪丸生精功能 缺血再灌注組同側(cè)睪丸的重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組同側(cè)睪丸的重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分均高于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。三組對側(cè)睪丸的重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。對照組睪丸可觀察到正常的曲細(xì)精管直徑和生精細(xì)胞層數(shù)，在曲細(xì)精管內(nèi)有許多成熟的精子和一個開放的管腔；缺血再灌注組同側(cè)睪丸表現(xiàn)出曲細(xì)精管萎縮和生精細(xì)胞層數(shù)減少；治療組同側(cè)睪丸曲細(xì)精管的結(jié)構(gòu)幾乎符合正常標(biāo)準(zhǔn)，曲細(xì)精管內(nèi)可見成熟的精子，但曲細(xì)精管的管腔內(nèi)包含有脫落的生精細(xì)胞，見圖4。

圖3 各組睪丸的重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分比較

圖4 各組睪丸的病理組織學(xué)切片

3 討論

如果睪丸扭轉(zhuǎn)持續(xù)超過6 h，將導(dǎo)致睪丸梗死[11]。即使在這段時間內(nèi)行外科手術(shù)復(fù)位，患者術(shù)后仍會出現(xiàn)睪丸萎縮[2]。本次研究顯示，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)2 h 后復(fù)位，雖然睪丸仍然存活，但復(fù)位后3 個月，睪丸生精功能嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為睪丸重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)和Johnsen 評分降低。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是一個典型的缺血再灌注損傷。但目前對于睪丸缺血再灌注損傷的機(jī)制仍然不明。

CREMτ 充當(dāng)著男性生精細(xì)胞分化的總開關(guān)，調(diào)控著生精細(xì)胞特異基因的轉(zhuǎn)錄[12]。缺乏CREMτ 基因的小鼠睪丸重量減輕20%～25%，曲細(xì)精管直徑降低20%～30%，精子發(fā)生停滯在早期階段[13]。因此，CREMτ 表達(dá)對精子發(fā)育成熟必不可少。本次研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)睪丸缺血再灌注后3 個月，同側(cè)睪丸的CREMτ 表達(dá)降低，生精功能也嚴(yán)重?fù)p傷。由于CREMτ 表達(dá)對精子發(fā)育成熟必不可少[13]，所以單側(cè)睪丸缺血再灌注后同側(cè)睪丸CREMτ 表達(dá)的降低可能導(dǎo)致了睪丸生精功能的損傷。然而，CREMτ 表達(dá)降低的原因仍然不明。

活性氧包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等?；钚匝蹙哂懈叻磻?yīng)性和壽命短的特點，直接定量檢測活性氧較為困難，而活性氧能引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的末端產(chǎn)物丙二醛。因此，丙二醛被廣泛作為一個敏感的活性氧指標(biāo)[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)睪丸缺血再灌注后，同側(cè)睪丸的丙二醛水平上升，表明睪丸缺血再灌注后會有過量的活性氧產(chǎn)生?；钚匝蹩梢酝ㄟ^調(diào)控基因的表達(dá)來影響細(xì)胞的分化[15]，結(jié)合上述的研究結(jié)果，提出以下假設(shè)：睪丸缺血再灌注后，過量產(chǎn)生的活性氧可能通過下調(diào)CREMτ 的表達(dá)來造成生精功能損傷。

當(dāng)前，一些藥物，如己酮可可堿，姜黃素和勃銳精等，已被證實在動物模型中治療睪丸缺血再灌注損傷是有效的[16-18]。然而，目前尚無藥物可用于臨床治療睪丸缺血再灌注損傷的患者。丹參是我國的傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀的功效，已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾?。ㄈ缧慕g痛、心肌梗死和腦梗死等）的臨床治療中[19]。丹酚酸B 是丹參中最豐富的生物活性成分，能清除活性氧，擁有極強(qiáng)的抗氧化活性[20]。據(jù)報道[9]，丹酚酸B 能降低心臟的缺血再灌注損傷。然而，丹酚酸B 對睪丸缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于缺血再灌注組，丹酚酸B 治療可降低同側(cè)睪丸的丙二醛水平，提高CREMτ的表達(dá)和生精功能，證實了上述的假設(shè)。同時，這些數(shù)據(jù)還表明，丹酚酸B 通過清除活性氧來上調(diào)CREMτ 表達(dá)，從而減輕睪丸的缺血再灌注損傷。

既往研究顯示[9]，丹酚酸B 在10 mg/kg 的劑量時能減輕大鼠的心臟缺血再灌注損傷。因此，本研究在大鼠睪丸缺血再灌注模型中選擇了這個劑量。研究發(fā)現(xiàn)，相比于缺血再灌注組，10 mg/kg 的丹酚酸B 治療可改善同側(cè)睪丸的生精功能，但是生精功能沒有恢復(fù)到正常水平。后期，本研究將進(jìn)一步探索丹酚酸B 的最佳治療劑量。

綜上所述，丹酚酸B 對睪丸的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其可能成為在臨床上治療睪丸缺血再灌注損傷的藥物，但需要進(jìn)一步的臨床試驗進(jìn)行驗證。

致謝：感謝浙江樹人大學(xué)樹蘭國際醫(yī)學(xué)院的戴欣怡、吳雨桐、柴敏嬌等人在實驗中的幫助。