曾麗丹， 陳容欽， 李曉云， 李 玲

(華南師范大學生命科學學院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

研究表明，組蛋白去乙酰化酶能調控植物根系生長[1]. 利用組蛋白去乙?；敢种苿㎞aB(Sodium Butyrate)處理玉米阻遏根分生組織細胞的有絲分裂，導致玉米根生長受到抑制[1]. 用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA(Trichostatin A)處理slr-1突變體能夠重新誘導側根形成，說明HDAC抑制側根形成[2]. 水稻中的組蛋白去乙?；窸sHDAC1降低OsNAC6啟動子相關部位的乙酰化水平，促進水稻主根生長[3]. 組蛋白去乙?；笇ΩL具有調控作用，且調控機制與生長素、基因表達和細胞分裂相關.

發(fā)根農桿菌誘導產生的毛狀根不會產生嵌合體且具有獨特性，是比較理想的遺傳材料[4-5]. 利用發(fā)根農桿菌把外源基因導入植物宿主方法有直接接種法、外植體接種法和原生質體共培養(yǎng)法，其中外植體接種法應用較廣，這種方法主要以植物的子葉、下胚軸、幼嫩的莖等部位作為外植體，將其浸泡在活化的發(fā)根農桿菌液中，經過共培養(yǎng)、抗性篩選得到無菌毛狀根[6]. 本文以花生葉片為外植體，通過外植體接種法獲得AhHDA1轉基因花生毛狀根.

AhHDA1是從花生葉片中克隆得到的組蛋白去乙?；富?，前期研究結果表明該基因轉入擬南芥中異源表達后抑制了細胞分裂相關基因AtCYCD1、AtE2Fb和生長素輸出相關基因AtPIN1、AtPIN2的表達水平，影響了生長素極性運輸,改變生長素在根部的積累和分布，從而影響分生區(qū)細胞分裂和伸長區(qū)細胞伸長，進而抑制擬南芥主根生長和側根形成[7]. 本實驗將表達載體35S∷eGFP、35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1分別轉入不同的花生毛狀根中獲得AhHDA1轉基因毛狀根，發(fā)現3種轉基因毛狀根側根生長狀況存在差異，故推測AhHDA1影響花生毛狀根側根生長. 本文研究AhHDA1對花生毛狀根側根生長的影響及機制，進一步了解AhHDA1對根系生長的調控作用.

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

選取飽滿的花生粵油7號種子浸泡過夜，次日轉移至培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)，萌發(fā)期間隔天換1次水. 種子萌發(fā)后，播種于盛有泥炭土的圓形花盆中. 培養(yǎng)至二葉期，取葉片作為基因轉化的外植體.

1.2 Ri質粒轉化花生

分別取帶有35S∷eGFP、35S∷AhHDA1-RNAi、35S∷AhHDA1-eGFP載體的K599重組菌進行活化，然后將菌擴大培養(yǎng)至A600達到0.6. 參照蘇良辰[8]的方法，對花生葉片進行表面消毒，切斷葉脈,在重組菌液中浸泡15 min，葉片轉至1/2MS(加頭孢霉素和硫酸卡那霉素)培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)獲得毛狀根.

1.3 RT-PCR檢測基因表達

取生長旺盛的花生毛狀根(約30天)200 mg，參照Trizol RNA試劑盒(購買自TaKaRa Bio Inc.)說明書提取根部總RNA，采用5X All-In-One RT MasterMix反轉錄試劑盒[購買自Applied Biological Materials (abm) Inc.]合成cDNA，以cDNA為模板使用Bio-Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀(購買自美國Bio-Rad)檢測基因的相對表達量. 擴增程序參照文獻[9]，檢測所用引物見表1.

1.4 核蛋白提取

取生長至旺盛期的花生毛狀根500 mg，參照劉星[10]的方法提取核蛋白.

1.5 蛋白表達檢測

提取的核蛋白參照SU等[11]的方法進行SDS-PAGE電泳，通過轉膜、孵化、顯影等步驟檢測不同轉基因毛狀根中AhHDA1的蛋白表達水平. 一抗為anti-AhHDA1，二抗為兔抗(購至鼎國生物公司).

1.6 啟動子活性分析

參照張拜宏[12]的方法獲得含以pGreen載體為骨架的pAhIAA28∷LUC和pAhCYCD4∷LUC載體的重組菌. 按質粒小提試劑盒說明書提取質粒. 參考劉星[10]的方法提取擬南芥原生質體，并將質粒轉入原生質體，參考Promega Dual-Luciferase報告基因檢測系統，收集原生質體并使用多功能酶標儀(購至PerkinElmer)測定(發(fā)射峰560 nm)響應載體的原生質體細胞的熒光淬滅值與內參進行比較，計算所得本載體的LUC值.

2 結果

2.1 轉基因AhHDA1毛狀根中AhHDA1的基因和蛋白表達

利用發(fā)根農桿菌將35S∷eGFP(對照，空質粒轉化)、35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1表達載體導入花生葉片，通過培養(yǎng)獲得AhHDA1轉基因毛狀根. 取出生長旺盛時期的毛狀根，鑒定3種轉基因毛狀根中AhHDA1的表達水平，結果表明：35S∷AhHDA1-RNAi轉基因毛狀根中AhHDA1的相對表達水平低于對照組，其AhHDA1的轉錄水平只有對照的60%，而35S∷AhHDA1毛狀根中AhHDA1的相對表達水平是對照的77.8倍.

圖2結果顯示，在35S∷eGFP轉基因毛狀根中檢測不到AhHDA1蛋白表達，而在35S∷AhHDA1毛狀根中AhHDA1的蛋白表達水平較高，說明AhHDA1轉入毛狀根中并正常表達.

圖2 35S∷eGFP和35S∷AhHDA1毛狀根AhHDA1的蛋白表達水平

2.2 AhHDA1的過表達對花生毛狀根的影響

在3種轉基因毛狀根中，均出現側根長和側根短2種不同的表型(圖3)，經統計發(fā)現，35S∷AhHDA1-RNAi轉基因毛狀根中側根長的毛狀根所占比例為31.7%(圖3A)，高于對照組(17.5%)和35S∷AhHDA1轉基因毛狀根(18.2%). 在35S∷AhHDA1轉基因毛狀根中側根短的毛狀根占39.4%(圖3B)，高于對照的15.0%和35S∷AhHDA1-RNAi轉基因毛狀根的2.4%. 說明AhHDA1在花生毛狀根中超表達后可能抑制了毛狀根側根生長.

圖3 不同表型的毛狀根在不同基因型花生毛狀根中的百分比

2.3 AhHDA1對毛狀根AhCYCD4和AhIAA28的表達及啟動子活性的影響

CYCD4編碼D型細胞周期蛋白，研究表明CYCD4能夠調節(jié)細胞的分裂潛能，使中柱細胞轉變成中柱起始細胞，從而影響側根原基形成；IAA28是AUX/IAA基因家族的成員，編碼生長素信號轉導的早期應答因子. 基因AhCYCD4和AhIAA28在35S∷AhHDA1-RNAi毛狀根中的表達水平被顯著下調(圖4)，而在35S∷AhHDA1毛狀根中這2個基因的表達水平皆被顯著上調. 說明AhHDA1調控細胞周期相關基因AhCYCD4和生長素信號轉導相關基因AhIAA28的表達.

圖4 AhHDA1對AhCYCD4和AhIAA28表達水平的調控

分別克隆獲得AhCYCD4和AhIAA28啟動子上游約2 000 bp的序列，皆含有啟動子活性調控、脅迫應答和光合作用相關的功能元件. AhHDA1顯著激活AhCYCD4和AhIAA28啟動子的轉錄活性(圖5)，說明AhHDA1直接調控基因AhCYCD4和AhIAA28.

圖5 AhHDA1對AhCYCD4和AhIAA28啟動子活性的調控

2.4 轉AhHDA1毛狀根中AhARF19和AhIAA28的表達

檢測ARF19在轉基因毛狀根中的相對表達水平，結果所示(圖6)，AhIAA28和AhARF19基因在35S∷AhHDA1-RNAi和35S∷AhHDA1毛狀根中的相對表達水平不同，其中AhIAA28在35S∷AhHDA1-RNAi毛狀根中的表達被抑制，而在35S∷AhHDA1毛狀根中的表達水平被上調；而AhARF19在35S∷AhHDA1-RNAi毛狀根中表達水平被上調，在35S∷AhHDA1毛狀根中表達被抑制，推測AhARF19是AhIAA28的下游基因，AhIAA28可能抑制AhARF19的表達，從而抑制毛狀根側根生長.

圖6 AhIAA28和AhARF19在轉AhHDA1毛狀根中的表達水平

3 討論

根的發(fā)育可塑性對于維持植物的生存和生長來說非常重要[13-14]，根的構型和生長主要與根分生組織的細胞分裂活性相關，與伸長區(qū)細胞的長度有關. CYCD4是D型細胞周期蛋白，能夠調節(jié)細胞的分裂潛能，使中柱細胞轉變成中柱起始細胞，從而影響側根原基形成，擬南芥CYCD4功能缺陷后，中柱細胞分裂速率減弱導致植株的側根密度減小[15]. 本文的研究結果表明，AhCYCD4在花生的35S∷AhHDA1毛狀根中轉錄水平顯著上調，在表型上與對照組相比，35S∷AhHDA1毛狀根側根的生長被抑制，側根數量沒有影響，推測AhCYCD4高水平表達可能誘導中柱細胞分裂，促進35S∷AhHDA1毛狀根側根原基形成，由于側根原基的分裂、生長過程中可能受到其他因素的影響，使其難以形成側根.

IAA28是AUX/IAAs家族成員，為生長素信號中的負調控因子，在響應生長素時發(fā)生泛素化降解使生長素信號繼續(xù)傳遞. 超表達IAA28的擬南芥?zhèn)雀鶖盗繙p少，而iaa28突變體植株的側根數是Col的2～3倍，說明IAA28在側根的形成過程中起抑制作用[16]. 本文結果顯示：超表達AhHDA1的花生毛狀根與對照組相比，其側根的生長被抑制，且AhIAA28在35S∷AhHDA1毛狀根中的表達水平顯著上調，說明AhIAA28表達上調后可能抑制了毛狀根側根生長，相關文獻只提出IAA28抑制側根形成，沒有涉及對側根生長的影響，我們推測有另一個基因，AhIAA28通過調控這個基因的表達進而調控毛狀根側根生長.

ARFs位于AUX/IAAs的下游，生長素含量較低時AUX/IAAs結合ARFs并抑制其活性. ARFs的B3結構域能夠結合生長素應答基因啟動子上的生長素響應元件(AuxRE)，從而影響這些基因的轉錄，在調控側根發(fā)育過程起重要作用[17].arf7arf19雙突變體的側根形成被完全抑制；ARF2、ARF3、ARF4等RNA受干擾后抑制側根生長[18-20]. 推測AhHDA1調控靶基因AhIAA28的表達水平后，可能影響AhIAA28的下游基因ARFs的表達，進而調控毛狀根側根生長. 檢測AhHDA1超表達毛狀根中AhARF19的相對表達水平發(fā)現，AhHDA1超表達抑制了AhARF19的表達水平，符合超表達AhHDA1抑制花生毛狀根側根生長的表型.AhHDA1在花生毛狀根中超表達后顯著上調了AhIAA28的表達水平，同時顯著抑制了AhARF19的表達，35S∷AhHDA1毛狀根的側根生長受抑制，推測AhARF19很可能是AhIAA28的下游基因. 因此，AhHDA1對花生毛狀根側根生長的調控機制可能是：AhHDA1激活AhCYCD4和AhIAA28啟動子的活性，從而上調這2個基因的相對表達水平，AhIAA28表達上調后抑制了其下游基因AhARF19的相對表達水平，從而抑制花生毛狀根側根生長. 關于AhARF19和AhIAA28與毛狀根側根生長之間的關系，兩者是否通過生長素AUX/IAA-ARF信號途徑作用，需要進一步分析AhHDA1毛狀根中AhIAA28的蛋白含量以及AhARF19的蛋白活性.