孫一帆,陳思,梁新紅,高瑩瑩
(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)
隨著人們生活水平的不斷提高和對食醋的營養(yǎng)價(jià)值和保鍵功能的充分認(rèn)識,以及科學(xué)研究對果醋功效特性的提示,市場上對果醋的需求量越來越大[1-3]。醋酸桿菌是醋酸發(fā)酵工業(yè)的主要用菌[4-5],因醋酸菌具有自滅性、易變異,不易保藏等特點(diǎn)[6],所以對醋酸桿菌的保藏方法和效果的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了在釀造生產(chǎn)過程中選育到優(yōu)秀的醋酸菌菌株,選擇適宜的保藏方法尤為重要。醋酸桿菌的常規(guī)保藏方法為斜面保藏和液體保藏,都需要定期傳代[7]。但是醋酸桿菌與其他菌種不同,很容易變異[8]。而定期傳代又增加了其退化和變異的概率,這樣會(huì)使寶貴的醋酸菌菌株得而復(fù)失,讓今后的研究不能正常進(jìn)行,甚至可能會(huì)給工業(yè)生產(chǎn)帶來很大的損失和危害[9]。因此,為了保持醋酸菌的優(yōu)良性狀和活力,選擇適宜的保藏方法尤為重要[10]。在眾多醋酸桿菌的保藏方法中,真空冷凍干燥保藏的方法提供的低溫、真空以及干燥的條件,可以使所保藏的菌株活性保存10年以上,且當(dāng)菌種被應(yīng)用時(shí),只需要添加水分進(jìn)行復(fù)水活化,具有使用方便、易保藏等特點(diǎn)[11-12]。
真空冷凍干燥方法的基本工藝是先將目標(biāo)菌株進(jìn)行高密度培養(yǎng),在菌株活力和濃度較高時(shí)收集菌體,然后將收集到的菌體懸浮在適宜的冷凍保護(hù)劑中進(jìn)行預(yù)凍,真空冷凍干燥過程中影響微生物活性的因素很多,其中預(yù)凍溫度和保護(hù)劑種類的影響尤為突出[13-15]。本試驗(yàn)主要研究了保護(hù)劑的種類和預(yù)凍溫度對醋酸桿菌活菌數(shù)及產(chǎn)酸量的影響,以期為果醋工業(yè)生產(chǎn)提供高活性醋酸菌凍干粉。
1.1.1 菌種
醋酸桿菌:A.pasteurianusSP001, 河南科技學(xué)院食品學(xué)院分離、鑒定、純化。
1.1.2 試劑
酵母膏、MgSO4·7H2O、KH2PO4、葡萄糖、無水乙醇、瓊脂、K2HPO4、氫氧化鈉、海藻糖、磷酸鉀緩沖液(分別配制濃度為0.05 mol/L的KH2PO4和0.05 mol/L的K2HPO4溶液,然后將配制好的兩種溶液混合,調(diào)節(jié)pH值范圍為5.5~6.0即可)、甘露醇、結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、沙黃、香柏油、二甲苯。
1.1.3 主要儀器
SW-CJ-ID單人單面垂直送風(fēng)(經(jīng)濟(jì)型)凈化工作臺 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司;WFJ7200分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司;FA124電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SHP恒溫生化培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;XSP-BM-2CA生物顯微鏡 上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;H1850R離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;1-4LSC冷凍干燥機(jī)、搖床 上海通特電訊設(shè)備廠;PHS-3C pH計(jì) 上海盛磁儀器有限公司。
1.2.1 冷凍干燥前菌種生長曲線的測定
1.2.1.1 液體培養(yǎng)基的配制
酵母膏1%、MgSO4·7H2O 0.2%、KH2PO40.3%、葡萄糖2%、pH值自然,于121 ℃滅菌20 min,備用,使用時(shí)加入3%的無水乙醇。
1.2.1.2 培養(yǎng)
分別編號1,2,3,4,5,6,7。每個(gè)錐形瓶中含液量100 mL,按照無菌操作法向7個(gè)錐形瓶中分別加入3%的無水乙醇和10%的果醋。接種后的錐形瓶置于搖床上,在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng),其中1號置于冰箱中作為對照。
1.2.1.3 測定
每隔3 h于波長610 nm處用分光光度計(jì)測定上述細(xì)菌菌懸液的吸光值。
1.2.1.4 繪制曲線
以細(xì)菌菌懸液的吸光值為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制其生長曲線。
1.2.2 菌懸液的制備
取3瓶裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶,每個(gè)錐形瓶中含液量100 mL,按照無菌操作法向3個(gè)錐形瓶中分別加入3%的無水乙醇和10%的葡萄醋。接種后的錐形瓶置于搖床上,在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)至菌密度最大,于4 ℃保存,用于冷凍干燥。
1.2.3 冷凍干燥
將菌密度達(dá)到最大時(shí)的菌懸液在9600 r/min、4 ℃的條件下離心10 min,倒去上清液,沉淀物用磷酸鉀緩沖液溶解后在上述條件下再次離心,除去上清液后沉淀物用保護(hù)劑溶解,然后倒入培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿中的液體厚度不能超過2 mm。將上述分裝好的培養(yǎng)皿口用保鮮膜封好,置于不同的溫度條件下預(yù)凍12 h,然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥。
1.3.1 活菌計(jì)數(shù)
液體培養(yǎng)基的配制:酵母膏1%、MgSO4·7H2O 0.2%、KH2PO40.3%、葡萄糖2%、瓊脂2%、pH值自然,于121 ℃滅菌20 min,備用,使用時(shí)加入3%的無水乙醇。在無菌工作臺上,將凍干后的菌種用無菌水溶解,用移液槍吸取0.3 mL的稀釋液于平板上,然后置于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)3~4 d后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
1.3.2 醋酸含量的測定
以標(biāo)定后的氫氧化鈉溶液(濃度接近0.1 mol/L)滴定發(fā)酵液,指示劑為酚酞試劑,結(jié)果以醋酸(g/dL)計(jì)。為了保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,每次測定進(jìn)行統(tǒng)一操作,步驟:1 mL發(fā)酵液→加入9 mL蒸餾水→加2滴酚酞→滴定記錄。
1.3.3 產(chǎn)酸曲線的測定
將干燥后的菌種用無菌水溶解,接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基中,測定其產(chǎn)酸量,以時(shí)間為橫坐標(biāo)、產(chǎn)酸量(g/dL)為縱坐標(biāo)繪制曲線,并與冷凍干燥前菌株的產(chǎn)酸量進(jìn)行對比。
1.3.4 凍干前后酒精轉(zhuǎn)化率的計(jì)算
將凍干前后的菌株接入液體培養(yǎng)基中,測定其最大產(chǎn)酸量,進(jìn)而計(jì)算其酒精轉(zhuǎn)化率。
轉(zhuǎn)化率(%)=產(chǎn)酸量(g/L)/發(fā)酵液酒精含量(g/L)/1.304。
產(chǎn)酸量(g/L)=最大產(chǎn)酸量(g/L)-培養(yǎng)基含酸量(g/L)-接入菌種的含酸量(g/L)。
1.3.5 冷凍干燥前后菌株在葡萄酒中的發(fā)酵效果的比較
分別將冷凍干燥前后的菌株接入液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、100 r/min 的搖床中培養(yǎng)3~4 d,使菌株活化,然后按照10%的接種量分別將冷凍干燥前后的菌種接入葡萄酒中,測定其產(chǎn)酸量,從而對真空冷凍干燥前后的菌株在葡萄酒中的發(fā)酵效果及發(fā)酵周期進(jìn)行比較。
采用DPS 7.55數(shù)據(jù)處理軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差顯著性進(jìn)行分析。
按照1.2.1所述生長曲線的測定方法,分別將編號1,2,3,4,5,6,7的每個(gè)錐形瓶中裝入液體培養(yǎng)基100 mL,按照無菌操作法向7個(gè)錐形瓶中分別加入3%的無水乙醇和10%的米醋。接種后的錐形瓶置于搖床上,在30 ℃、100 r/min的條件下振蕩培養(yǎng),其中1號置于冰箱中作為對照。然后每隔3 h于波長610 nm處用分光光度計(jì)測定細(xì)菌菌懸液的吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線,結(jié)果見圖1。
圖1 冷凍干燥前A. pasteurianus SP001的生長曲線Fig.1 The growth curve of A. pasteurianus SP001 before freeze drying
由圖1可知,0~10 h為A.pasteurianusSP001的延滯期,12~36 h為A.pasteurianusSP001的對數(shù)生長期,36~66 h為穩(wěn)定期,66 h后,菌體生長速率小于其死亡速率,進(jìn)入衰亡期。因此,用于真空冷凍干燥的菌體應(yīng)為培養(yǎng)到36 h的菌體,以使冷凍干燥后獲得較多的菌體。
依據(jù)1.2.3和1.3.1的方法,對預(yù)凍后的菌體進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),結(jié)果見圖2。
圖2 預(yù)凍溫度對冷凍干燥后菌株活性的影響Fig.2 Effect of pre-freezing temperature on the activity of bacteria after freeze drying
由圖2可知,預(yù)凍溫度為-30 ℃時(shí),當(dāng)保護(hù)劑為10%的葡萄糖+2%的海藻糖時(shí),其活菌數(shù)為(450±21) CFU/mL,當(dāng)保護(hù)劑為10%的甘露醇時(shí),其活菌數(shù)為(260±12) CFU/mL。而當(dāng)預(yù)凍溫度為-60 ℃時(shí),兩種保護(hù)劑的活菌數(shù)分別為(680±23) CFU/mL和(500±19) CFU/mL。當(dāng)預(yù)凍溫度為-90 ℃時(shí),兩種保護(hù)劑的活菌數(shù)分別為(520±16) CFU/mL和(310±12) CFU/mL。-60 ℃預(yù)凍的效果比-30 ℃預(yù)凍的效果較好,這可能是因?yàn)榫鷳乙涸?30 ℃預(yù)凍時(shí),其溫度已降至冰點(diǎn)以下,但結(jié)冰不夠堅(jiān)實(shí),真空干燥時(shí)易使菌懸液沸騰,菌體細(xì)胞受損失較多。而在-60 ℃預(yù)凍時(shí),結(jié)冰速度快且堅(jiān)實(shí),細(xì)胞損傷較少。因此,-60 ℃的預(yù)凍溫度最好。
2.3.1 不同保護(hù)劑對冷凍干燥后狀態(tài)的影響
按照1.2.3所述的方法進(jìn)行真空冷凍干燥,經(jīng)過冷凍干燥后,菌體與保護(hù)劑的混合物失去水分而成干燥狀態(tài),結(jié)果見圖3和圖4。
圖3 10%的葡萄糖+2%的海藻糖
圖4 10%的甘露醇
由圖3和圖4可知,保護(hù)劑為10%的葡萄糖+2%的海藻糖時(shí),冷凍干燥后培養(yǎng)皿中的糖分殘余物較少,而當(dāng)保護(hù)劑為10%的甘露醇時(shí),培養(yǎng)皿中的固體殘余物較多,冷凍干燥后除去水分,使甘露醇過飽和而析出,與溶解前的狀態(tài)無太大差異,因此從這方面來看,以10%的葡萄糖+2%的海藻糖為保護(hù)劑的冷凍干燥效果比較好。
2.3.2 不同保護(hù)劑對冷凍干燥后菌種活性的影響
按照1.2.3和1.3.1的方法,對不同保護(hù)劑對冷卻干燥后菌株活性進(jìn)行研究,結(jié)果見圖5。
圖5 不同保護(hù)劑對冷凍干燥后菌株活性的影響Fig.5 Effects of different protective agents on the activity of bacteria after freeze drying
由圖5可知,在-60 ℃的預(yù)凍溫度下,以10%的葡萄糖+2%的海藻糖為保護(hù)劑時(shí),活菌數(shù)為(680±23) CFU/mL,而當(dāng)以10%的甘露醇為保護(hù)劑時(shí),活菌數(shù)為(500±19) CFU/mL。兩者相差180 CFU/mL,因此,由上述結(jié)果可知以10%葡萄糖+2%的海藻糖為保護(hù)劑的細(xì)胞存活數(shù)較高,而以10%的甘露醇為保護(hù)劑的細(xì)胞存活數(shù)較低。因此,選擇10%的葡萄糖+2%的海藻糖作為A.pasteurianusSP001的凍干保護(hù)劑。
按照1.2.1和1.3.2的方法,將干燥前后的菌種分別接種在液體培養(yǎng)基中,測定其產(chǎn)酸量(g/dL),結(jié)果見圖6。
圖6 冷凍干燥前后菌種的產(chǎn)酸量比較Fig.6 Comparison of acid production of bacteria before and after freeze drying
由圖6可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行,冷凍干燥前后的菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量都有所增加,真空冷凍干燥前的A.pasteurianusSP001在第7天時(shí)產(chǎn)酸量達(dá)到了最大值,即(2.86±0.08) g/dL,而冷凍干燥后的菌種在第9天的達(dá)到最大產(chǎn)酸量(2.63±0.07) g/dL,兩者的最大值相差0.23 g/dL,相差量為8.1%,但是,在醋酸發(fā)酵的第3天到第5天,冷凍干燥前后產(chǎn)酸量明顯不同,冷凍干燥后菌種延滯期延長,因此,要獲得較高產(chǎn)酸量,冷凍干燥后A.pasteurianusSP001發(fā)酵時(shí)間最佳為9 d。
依照1.3.3的方法,將凍干前后的菌種接入培養(yǎng)基中,測定其最大產(chǎn)酸量,計(jì)算其酒精轉(zhuǎn)化率,結(jié)果見表1。
表1 冷凍干燥前后菌種的酒精轉(zhuǎn)化率Table 1 The ethanol conversion rate before and after freeze drying
由表1可知,真空冷凍干燥前菌種的酒精轉(zhuǎn)化率為73.00%,冷凍干燥后菌種的酒精轉(zhuǎn)化率為67.67%,表明冷凍干燥對菌株與未凍干菌株的活性有差異顯著性,其差值為5.33%。
按照1.3.5的方法,分別將冷凍干燥前后的菌種接入葡萄酒中,將葡萄酒發(fā)酵轉(zhuǎn)化為葡萄醋,在發(fā)酵過程中,測定其產(chǎn)酸量(g/dL),分析冷凍干燥前后菌種的活性以及發(fā)酵周期的差別,結(jié)果見圖7。
圖7 冷凍干燥對A. pasteurianus SP001在葡萄酒中發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of freeze drying on the fermentation of A. pasteurianus SP001 in wine
由圖7可知,真空冷凍干燥前,菌種在葡萄酒中發(fā)酵,在第10天就達(dá)到最大產(chǎn)酸量(6.06±0.14) g/dL,而冷凍干燥后的菌種在第13天時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)酸量(5.85±0.15) g/dL,并趨于穩(wěn)定。冷凍干燥前后最大產(chǎn)酸量相差0.21 g/dL,其相差量為3.5%,但是冷凍干燥后的發(fā)酵周期卻延長1 d。
以A.pasteurianusSP001為研究對象,通過對真空冷凍干燥過程中預(yù)凍溫度和保護(hù)劑種類的研究,采用10%葡萄糖+2%海藻糖制成的醋酸菌保護(hù)劑,經(jīng)-60 ℃的預(yù)凍所制成的凍干菌的保藏效果良好。A.pasteurianusSP001培養(yǎng)36 h后進(jìn)行冷凍干燥,凍干粉在乙醇含量為3%(V/V)培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 d時(shí)醋酸產(chǎn)量最大,產(chǎn)值為(2.63±0.07) g/dL,在乙醇含量為6%(V/V)葡萄酒中發(fā)酵第13天醋酸產(chǎn)量最大,產(chǎn)值為(5.85±0.15) g/dL。真空冷凍干燥后菌種活性較好,能夠進(jìn)行果醋釀造的工業(yè)應(yīng)用。A.pasteurianusSP001凍干粉發(fā)酵時(shí)間相對新鮮菌種較長,其原因及機(jī)理還需進(jìn)一步研究。隨著果醋釀造技術(shù)的發(fā)展以及真空冷凍干燥微生物技術(shù)的日益完善,真空冷凍干燥醋酸菌粉必將為果醋行業(yè)提供巨大的發(fā)展空間,也將為我國食品行業(yè)的發(fā)展做出很大的貢獻(xiàn),相信在未來會(huì)有更完善的技術(shù)和設(shè)備在這方面加以應(yīng)用。