劉思妤 李 懿 譚 慧 黃 甜 張宇琴 谷 彬

湘南學(xué)院藥理學(xué)教研室，湖南郴州 423000

糖尿病是由胰島素分泌不足或抵抗引發(fā)的慢性代謝性疾病，而糖尿病血管病變是糖尿病患者死亡的主要原因[1]。已有研究表明，糖尿病的胰島素抵抗及持續(xù)高糖狀態(tài)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎癥因子，最終會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[2-4]，而內(nèi)皮功能障礙會(huì)加劇動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[5]。因此，尋找控制高血糖所致炎癥反應(yīng)的藥物能有效防治糖尿病血管損傷。紫背天葵又名天葵子，為秋海棠科秋海棠屬植物，是藥食同源的植物，有很高的保健開(kāi)發(fā)價(jià)值[6]。近年來(lái)有研究表明，紫背天葵具有清熱解毒、潤(rùn)燥、止咳化痰、涼血止血、消炎散瘀、消腫、降糖等生理活性[7]，但是目前對(duì)紫背天葵抗糖尿病血管病變的研究相對(duì)較少。 基于此，本研究主要通過(guò)建立糖尿病小鼠模型，探討紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠糖代謝、大血管損傷的影響及可能機(jī)制，探討其對(duì)糖尿病小鼠血管的保護(hù)作用是否與抗炎有關(guān)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取2019 年6 月至8 月購(gòu)得的健康SPF 級(jí)雄性昆明小鼠[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]60 只，體重 15~18 g。 高脂高糖飼料配方為：10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸納、66.5%常規(guī)飼料[8]。

1.2 主要儀器與試劑

R-1001VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；EDC-810 基因擴(kuò)增儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；QuantStudioTM3 Real-Time PCR 儀（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；Legend Micro17R 冷凍高速離心機(jī)（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；Cytation 1細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek 公司）；Centrifuge5810 R 冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf 公司）；二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma 公司） 臨用前用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.2）配置，5 min 內(nèi)用完；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 白介素-10（interleukin-10，IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；膽酸鈉、豬油、鼠飼料（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Fermentas 公司）；TRIzol 試劑盒（Invitrogen 公司）；IL-1β、IL-10、TNF-α 引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 紫背天葵水提物的制備 紫背天葵藥材購(gòu)于老百姓大藥房，經(jīng)湘南學(xué)院藥學(xué)院藥用植物教研室鑒定為菫菜目秋海棠科秋海棠屬。取紫背天葵400 g，粉碎，水提，10 倍體積的水浸泡30 min，微沸回流提取2 h，收集濾液，濾渣再加8 倍量水，微沸回流提取2 h，收集濾液。提取液進(jìn)行200 目紗濾，合并兩次濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮， 濃縮溫度均在60℃左右，濃縮至適量， 得浸膏， 收膏量為46 g， 得率為11%，80℃以下真空干燥。

1.3.2 糖尿病小鼠模型的制備及分組 取健康SPF 級(jí)昆明種雄性小鼠60 只分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物室內(nèi)， 室溫20~25℃，明暗各12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)取6只作為正常對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼料，其余54 只飼喂高脂飼料，4 周后除正常對(duì)照組外， 其余各組均禁食不禁水 12 h，連續(xù)3 d 腹腔注射 STZ 30 mg/kg，進(jìn)一步增強(qiáng)小鼠的代謝紊亂， 繼續(xù)給予高脂飼料1 周，1 周后禁食16 h，測(cè)定空腹血糖，血糖值>11.0 mmol/L 為造模成功小鼠，剔除未造模成功的小鼠，將剩下的30 只造模成功小鼠分為糖尿病模型組、紫背天葵提取物不同劑量組、二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組，每組6 只，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料。紫背天葵提取物組采用0.75、1.5、3 g/kg 灌胃，二甲雙胍組采用150 mg/kg 灌胃，糖尿病模型組采用生理鹽水灌胃，灌胃4 周后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 測(cè)定小鼠體重、空腹血糖、葡萄糖耐量 末次給藥后禁食不禁水12 h，稱量小鼠體重，尾尖取血，用血糖儀測(cè)定空腹血糖值， 然后各組灌胃葡萄糖2 g/kg，在 0、0.5、1、1.5、2 h 時(shí)分別從尾部取血檢測(cè)血糖值，采用口服葡萄糖耐量 （oral glucose tolerance test，OGTT）試驗(yàn)檢測(cè)糖尿病模型小鼠的血糖曲線下面積。1.4.2 血清中炎癥因子含量測(cè)定 摘眼球取血， 血液4℃靜置 30 min，12 000 r/min 離心 20 min，吸出上清液即為血清， 采用ELISA 法測(cè)定血清中 IL-1β、IL-10、TNF-α 的含量。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測(cè) IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA 的表達(dá) 提取小鼠的胸主動(dòng)脈組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，隨后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列如下。 （IL-1β）F：5′-CAGGATGAGGACAT GAGCAC-3′，R：5′-CAGTTGTCTAATGGGAACGTCA-3′；（IL-10）F：5′-GCTCTTACTGACTGGCATGA-3′，R：5′-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG-3′；（TNF-α）F：5′-ACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′，R：5′-CTCCTCCAC TTGGTGGTTTG-3′；（β-actin）F：5′-AGAGGGAAATC GTGCGTGAC-3′，R：5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′。引物由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)條件：94℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，共 40 個(gè)循環(huán)。 運(yùn)用comparative 2-△△CT法分析基因的相對(duì)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

糖尿病模型組小鼠的體重低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；0.75 g/kg 紫背天葵提取物組小鼠的體重與糖尿病模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；1.5、3 g/kg 紫背天葵提取物組及二甲雙胍組的小鼠體重高于糖尿病模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 1）。

圖1 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

2.2 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖及血糖曲線下面積的影響

糖尿病模型組小鼠的空腹血糖高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；1.5、3 g/kg 紫背天葵提取物組及二甲雙胍組小鼠的血糖低于糖尿病模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 糖尿病模型組小鼠的血糖下面積高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；1.5、3 g/kg 紫背天葵提取物組及二甲雙胍組小鼠的血糖下面積低于糖尿病模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2）。

圖2 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖及血糖曲線下面積的影響

2.3 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠血清炎癥因子的影響

糖尿病模型組小鼠的IL-1β、TNF-α 含量高于正常對(duì)照組，IL-10 含量低于正常對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；二甲雙胍組及 0.75、1.5、3 g/kg 紫背天葵提取物組的IL-1β 含量低于糖尿病模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；二甲雙胍組及 1.5、3 g/kg 紫背天葵提取物組的TNF-α 含量低于糖尿病模型組，IL-10 含量高于糖尿病模型組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 3）。

圖3 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠血清炎癥因子含量的影響

2.4 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響

糖尿病模型組小鼠的胸主動(dòng)脈IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)高于正常對(duì)照組，IL-10 mRNA 表達(dá)低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；1.5、3 g/kg紫背天葵提取物組及二甲雙胍組小鼠的胸主動(dòng)脈IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)低于糖尿病模型組，IL-10 mRNA 表達(dá)高于糖尿病模型組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 4）。

圖4 紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響

3 討論

大血管病變是糖尿病慢性并發(fā)癥中致死、致殘的重要因素之一，而糖尿病所致的慢性炎癥反應(yīng)則是該并發(fā)癥的主要原因之一[9]。有研究表明，糖尿病及血管病變是一種慢性炎癥性疾病[10-11]，血液中炎癥因子水平升高以及抑炎因子水平下降可引起血管內(nèi)皮功能障礙、血管炎癥反應(yīng)的增加，促進(jìn)糖尿病血管病變的發(fā)生和發(fā)展[12-13]，而抑制炎癥反應(yīng)能有效延緩疾病進(jìn)程[14]。 目前，應(yīng)用有效藥物能延緩和控制糖尿病引起的慢性炎癥性血管并發(fā)癥， 但是這是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，且毒副作用強(qiáng)。 天然的降糖抑炎物質(zhì)具有毒副作用小、安全有效、患者依從性更好的優(yōu)點(diǎn)，以此作為糖尿病慢性炎癥血管病變的治療具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

紫背天葵是藥食同源的藥用植物，富含鐵、維生素A、維生素C、胡蘿卜素、鈣等多種微量元素，具有清熱解毒、散瘀消腫、活血止血、潤(rùn)肺止咳、提高人體免疫力等功效[15]。 有研究報(bào)道，紫背天葵中含有黃酮類成分，能降低糖尿病大鼠的血糖[16]。 本研究也證實(shí)，紫背天葵水提物能有效地降低糖尿病小鼠的血糖，并且能改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量，改善機(jī)體對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，說(shuō)明紫背天葵提取物對(duì)糖尿病小鼠的糖代謝紊亂起到了一定程度的改善作用。糖尿病發(fā)展末期，體重顯著下降，機(jī)體免疫力下降，本研究結(jié)果顯示， 紫背天葵提取物能顯著提高糖尿病小鼠的體重，增強(qiáng)糖尿病小鼠的體質(zhì)。

糖尿病血管病變是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)參與了血管病變的整個(gè)過(guò)程。血清炎癥因子水平升高可引起血管內(nèi)皮功能障礙、凋亡增加，促進(jìn)血管病變的發(fā)生和發(fā)展[17-19]。本研究結(jié)果顯示，紫背天葵提取物能降低糖尿病小鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平， 同時(shí)降低胸主動(dòng)脈IL-1β、TNF-α 炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平。 IL-10 被稱為“細(xì)胞因子合成抑制因子”，具有一定抗炎效應(yīng)[20]。 本研究結(jié)果顯示，紫背天葵提取物能在一定程度增加糖尿病小鼠血中IL-10 的含量及胸主動(dòng)脈IL-10 的表達(dá)，從另一方面證實(shí)紫背天葵提取物具有抗炎作用。

綜上所述，紫背天葵提取物能有效降低糖尿病小鼠的血糖， 改善糖尿病小鼠對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)糖尿病小鼠的體重并能改善糖尿病小鼠血管并發(fā)癥，其機(jī)制可能與抑制其炎癥反應(yīng)有關(guān)，為藥食同源植物紫背天葵的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。