鄭 洲, 付 橋

(湖北省武漢市第三醫(yī)院, 1. 急診科, 2. 泌尿外科, 湖北 武漢, 430014)

急性胰腺炎(AP)是胰腺的一種炎癥性疾病, 80%患者病情輕微，無嚴(yán)重并發(fā)癥，總體病死率為5%, 但重癥AP患者的病死率可高達(dá)30%[1]。miRNA是一種高度保守的非編碼RNA, 包含18～24個(gè)核苷酸，通過抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解而成為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[2]。自噬在AP的發(fā)病中起著非常重要的作用，可導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞中胰蛋白酶原激活并引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生和加劇[3]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)也稱為熱休克蛋白家族A成員5(HSPA5), 屬于HSP70家族，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用[4]。在饑餓條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中心的蛋白質(zhì)合成發(fā)生改變，可使未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞自噬[5]。HSPA5可識(shí)別錯(cuò)誤折疊的多肽，并與蛋白酶結(jié)合使其降解，參與細(xì)胞自噬過程[6]。研究[7]顯示, miR-181可通過調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生參與鋸齒狀腺瘤癌變的過程。本研究檢測(cè)AP患者血清GRP78、miR-181-5p表達(dá)水平并分析其臨床意義，以期為臨床防治AP提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月—2020年9月武漢市第三醫(yī)院收治的141例AP患者作為研究對(duì)象，患者均符合《中國(guó)急性胰腺炎多學(xué)科診治(MDT)共識(shí)意見(草案)》[8]的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)《2012版急性胰腺炎分類: 亞特蘭大國(guó)際共識(shí)的分類和定義的修訂》[9]將患者分為輕癥組86例和重癥組55例。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 發(fā)病前無消化道疾病史、內(nèi)分泌疾病史者; ② 病歷資料完整者; ③ 入院前未接受AP相關(guān)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 慢性胰腺炎患者;② 近3個(gè)月內(nèi)使用激素或免疫抑制劑治療者; ③ 存在嚴(yán)重心、肺、腎等器官功能障礙者; ④ 合并免疫缺陷病、急慢性肝炎、惡性腫瘤及外傷者。另選取同期體檢的健康人員100例納入對(duì)照組。收集受試者的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓、冠心病、糖尿病、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等一般資料。本研究經(jīng)武漢市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施，且所有患者及其家屬簽署知情同意書，研究方法符合《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑(美國(guó)Invirotrogen公司，貨號(hào)15596026); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海吉至生化科技有限公司，貨號(hào)RP1105-50T); SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR試劑盒(大連TaKaRa公司); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied biosygtems公司，型號(hào)7300型); 醫(yī)用離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司型號(hào), DT5-6); 全自動(dòng)生化分析儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，型號(hào)Cobas c 701); 引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及保存: 受試者入院后經(jīng)肘靜脈穿刺抽取外周血3 mL, 靜置30 min, 室溫下3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 吸取上清液即得血清，裝入EP管中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生物信息學(xué)分析: 通過檢索生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫Targetscan(http: //www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-181-5p與GRP78的靶向結(jié)合情況。

1.3.3 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表達(dá)水平檢測(cè): 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)。按照Trizol法提取AP患者血清總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度及濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，內(nèi)參分別選用U6、GAPDH基因, miR-181-5p、GRP78 mRNA、U6、GAPDH引物序列見表1。反應(yīng)條件: 95 ℃ 10 min; 40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 15 s)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-181-5p、GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

3組受試者年齡、性別及TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。輕癥組、重癥組初診時(shí)白細(xì)胞(WBC)水平高于對(duì)照組，血紅蛋白(Hb)、血小板(PLT)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 重癥組初診時(shí)WBC水平高于輕癥組，Hb、PLT水平低于輕癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者一般資料比較

2.2 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表達(dá)水平比較

重癥組、輕癥組血清miR-181-5p表達(dá)水平高于對(duì)照組, GRP78 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 重癥組血清miR-181-5p表達(dá)水平高于輕癥組, GRP78 mRNA表達(dá)水平低于輕癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè), miR-181-5p與GRP78存在結(jié)合位點(diǎn)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示, miR-181-5p與GRP78 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.665,P<0.05)。見圖1。

2.4 重癥AP的影響因素分析

以受試者是否發(fā)生重癥AP為因變量，以受試者血清WBC、Hb、PLT、miR-181-5p、GRP78 mRNA表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析。分析結(jié)果顯示，血清WBC、Hb、PLT不是受試者發(fā)生重癥AP的影響因素(P>0.05); miR-181-5p表達(dá)水平偏高、GRP78 mRNA表達(dá)水平偏低是受試者發(fā)生重癥AP的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 重癥AP影響因素的二元Logistic回歸分析

2.5 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)重癥AP的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線顯示，血清miR-181-5p預(yù)測(cè)重癥AP的曲線下面積(AUC)為0.836(95%CI為0.759～0.913), 敏感性為85.2%, 特異性為80.3%; 血清GRP78 mRNA預(yù)測(cè)重癥AP的AUC為0.741(95%CI為0.649～0.833), 敏感性為82.0%，特異性為70.5%。二者聯(lián)合預(yù)測(cè)重癥AP的AUC為0.861(95%CI為0.791～0.930), 敏感性為82.0%、特異性為85.2%。見圖2。

3 討 論

目前, AP的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展規(guī)律尚未完全闡明，其中重癥AP的病情尤其兇險(xiǎn)，患者手術(shù)病死率較高。近年來, AP相關(guān)研究不斷取得進(jìn)展，大多數(shù)研究者認(rèn)為胰酶原在胰腺細(xì)胞內(nèi)非正常激活是造成AP發(fā)生的原因。胰腺細(xì)胞內(nèi)胰酶原的激活機(jī)制目前尚未闡明，有研究稱自噬參與了該過程，但關(guān)于自噬在該過程中起保護(hù)作用還是損害作用尚存較大爭(zhēng)議。

GRP78蛋白的分子量為70 KDa, 主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊、保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能，通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和功能，誘導(dǎo)自噬發(fā)生[10]。韓世強(qiáng)等[11]發(fā)現(xiàn), GRP78在小鼠腦缺血再灌注損傷中起保護(hù)作用，可通過促進(jìn)自噬，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。張志標(biāo)等[12]報(bào)道, GRP78上調(diào)可修復(fù)雨蛙肽對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的損傷，對(duì)治療胰腺炎有所幫助。除細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白參與的信號(hào)機(jī)制外, miRNA在自噬調(diào)節(jié)中也起著重要的中心作用[13]。miR-181是一種新的重要的自噬調(diào)節(jié)劑，其過度表達(dá)可導(dǎo)致饑餓和雷帕霉素誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞和人髓性白血病細(xì)胞自噬的減弱[14]。病理狀態(tài)下，自噬受損，炎癥水平升高，可能加重AP, 李霞等[15]發(fā)現(xiàn)AP小鼠模型中炎癥水平升高，自噬相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)。本研究中，重癥AP患者GRP78 mRNA水平顯著低于輕癥組和對(duì)照組, miR-181-5p水平顯著高于輕癥組和對(duì)照組，提示GRP78、miR-181-5p可能與AP發(fā)生及病情嚴(yán)重程度有一定關(guān)聯(lián)。

本研究顯示, miR-181-5p表達(dá)水平偏高、GRP78 mRNA表達(dá)水平偏低是重癥AP發(fā)生的危險(xiǎn)因素，猜測(cè)是由于miR-181-5p過表達(dá)，抑制胰腺組織細(xì)胞自噬和GRP78 mNRA表達(dá)，而GRP78表達(dá)減弱，無法誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，導(dǎo)致胰腺組織發(fā)生更嚴(yán)重的損傷。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-181-5p預(yù)測(cè)重癥AP的AUC為0.836(95%CI為0.759～0.913), 血清GRP78 mRNA的AUC為0.741(95%CI為0.649～0.833), 二者聯(lián)合的AUC為0.861(95%CI為0.791～0.930)。由此提示, GRP78、miR-181-5p對(duì)AP進(jìn)展為重癥AP均具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，且聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值更高，可作為潛在的預(yù)測(cè)重癥AP的生物標(biāo)志物。此外, Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181-5p與GRP78存在結(jié)合位點(diǎn)，且miR-181-5p與GRP78 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能存在調(diào)控關(guān)系，其具體機(jī)制需在今后擴(kuò)大樣本量后深入探討。

綜上所述, AP患者血清GRP78 mRNA表達(dá)水平降低, miR-181-5p表達(dá)水平升高。血清miR-181-5p、GRP78與AP嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為潛在的預(yù)測(cè)重癥AP的標(biāo)志物。本研究納入樣本量相對(duì)較少，未檢測(cè)自噬相關(guān)因子，且未深入研究miR-181-5p、GRP78共同作用與AP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，有待后續(xù)深入探究。