羅青松，張季，李臻，楊思原，孔舷淑，鄒天寧

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺科，昆明 650118)

乳腺癌在女性惡性腫瘤中的發(fā)病率較高，對女性的身心健康造成巨大危害。據(jù)報道，約10%的乳腺癌具有遺傳性，而高達25%的遺傳性乳腺癌與生殖有關(guān)，目前研究較多的為乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA)1和BRCA2，攜帶BRCA1或BRCA2的人群終生患乳腺癌及卵巢癌的風(fēng)險較正常人群顯著升高[1]。抑癌基因BRCA1和BRCA2可以通過同源重組(homologous recombination，HR)修復(fù)進行DNA雙鏈斷裂修復(fù)，其功能的缺失容易導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性，進而導(dǎo)致腫瘤細胞的產(chǎn)生[2]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]是一種DNA修復(fù)酶，其能夠識別DNA受損的片段并被激活，從而進行堿基切除修復(fù)，在DNA單鏈斷裂修復(fù)、調(diào)控程序化細胞死亡、維持DNA穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[3]。BRCA與PARP分別通過不同的信號通路進行DNA損傷的識別與修復(fù)，對維持基因的穩(wěn)定性具有重要意義。研究表明，PARP抑制劑對BRCA1和BRCA2突變的腫瘤細胞異常敏感，因此PARP抑制劑被用于治療HR缺陷的惡性腫瘤[4]。由于PARP抑制劑能與HR修復(fù)缺陷產(chǎn)生協(xié)同致死效應(yīng)，其在治療BRCA1/2突變癌癥患者中取得了重大成功。但PARP抑制劑的臨床研究和應(yīng)用還存在許多問題，其抗腫瘤機制與耐藥性分子機制仍未完全明確?，F(xiàn)就PARP抑制劑在乳腺癌中的作用機制及耐藥性相關(guān)研究進展予以綜述。

1 PRAP及PARP抑制劑概述

1.1PARP的結(jié)構(gòu)與功能 PARP在DNA修復(fù)通路中起關(guān)鍵作用。PARP家族有17個成員，其催化區(qū)域具有同源性[5]。PARP家族的酶將聚ADP核糖鏈與目標(biāo)蛋白酶共價連接的過程稱為多聚核糖基化[6]。在PARP家族的所有蛋白質(zhì)中，PARP1是最重要的PARP，在DNA損傷修復(fù)中，PARP1產(chǎn)生了近90%的多聚核糖基化[7]。PARP1有3個結(jié)構(gòu)域，分別為3個鋅指結(jié)構(gòu)(Zn Ⅰ、ZnⅡ、ZnⅢ)構(gòu)成的N端 DNA結(jié)合域、1個BRCA1 C端結(jié)合域構(gòu)成的中間調(diào)節(jié)域和1個C端催化域，其中C端催化域又由3個亞結(jié)構(gòu)域組成：1個富含色氨酸-甘氨酸-精氨酸域、α螺旋結(jié)構(gòu)域和ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域[8]。

在DNA未與PARP結(jié)合的狀態(tài)下，α螺旋結(jié)構(gòu)域可以抑制PARP1中的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶與β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)結(jié)合[9]。當(dāng)出現(xiàn)DNA單鏈斷裂后，PARP1中的鋅指相關(guān)結(jié)構(gòu)域識別DNA缺口并與之相互作用，PARP1與受損的DNA鏈結(jié)合后，α螺旋結(jié)構(gòu)域的自抑制功能被取消，從而激活A(yù)DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的催化功能，將NAD+分解為煙酰胺和ADP核糖，再將ADP核糖作為底物，使受體蛋白(主要為PARP)自身聚ADP核糖化，形成PARP1-ADP核糖支鏈[10]。PARP1-ADP核糖支鏈可以促進DNA修復(fù)元件的募集和染色質(zhì)重塑[11]。而聚腺苷二磷酸核糖水解酶[poly(ADP-ribosy) glycohydrolase，PARG]可以使解離下來的PARP1-ADP核糖支鏈分解成ADP核糖和PRAP，煙酰胺可以重新利用ADP核糖再次合成NAD+，PARP則可以繼續(xù)介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)[12]。

1.2PARP抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能 PARP抑制劑的成分主要為NAD+類似物，其可以與NAD+競爭性結(jié)合PARP催化結(jié)構(gòu)域的活性位點，使PARP的活性受到抑制，進而影響PARP1-ADP核糖支鏈的形成并使之不能招募DNA損傷相關(guān)修復(fù)蛋白，最終造成DNA損傷修復(fù)失敗[13]。第一代PARP1抑制劑為煙酰胺，其次為3-氨基苯甲酰胺。隨后開發(fā)的所有PARP1抑制劑均包含煙酰胺/苯甲酰胺藥效團，并與NAD+競爭PARP的催化中心[14]。目前，已有4種PARP抑制劑(Rucaparib、Olaparib、Niraparib和Tala-zoparib)獲得美國食品藥品管理局和歐洲藥品管理局的批準(zhǔn)。

2 PARP抑制劑在乳腺癌中的作用機制

2.1協(xié)同致死效應(yīng) 協(xié)同致死效應(yīng)即PARP抑制劑可以選擇性殺傷BRCA突變引起的HR功能修復(fù)缺陷的腫瘤細胞，而對BRCA正常的細胞沒有影響[15]。開發(fā)PARP抑制劑的基本原理就是基于協(xié)同致死性的概念，其中兩個基因的突變構(gòu)成協(xié)同致死效應(yīng)，但是一個單獨的突變則可以維持細胞的活力[16]。BRCA1與BRCA2是抑癌基因，它們通過HR參與雙鏈DNA斷裂修復(fù)，以維持基因組完整性。但BRCA突變的癌細胞存在HR缺陷會導(dǎo)致染色體異常，進而引起染色體的不穩(wěn)定[17]。有研究顯示，PARP1參與了DNA單鏈斷裂的修復(fù)，DNA單鏈斷裂的持續(xù)損壞可能會引起復(fù)制叉的崩塌，從而產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通常由HR來修復(fù)[18]。因此，用PARP抑制劑處理過的BRCA突變的癌細胞會累積DNA單鏈斷裂，導(dǎo)致基因雙鏈斷裂不能通過HR途徑修復(fù)，最終引起細胞周期停滯進而死亡[19]?？梢姡瑓f(xié)同致死效應(yīng)是PARP抑制劑作為一種單藥消滅腫瘤細胞的直接作用機制。

2.2PARP-DNA捕獲理論 除了協(xié)同致死效應(yīng)外，Murai等[20]提出了PARP抑制劑的第二種作用機制，即將PARP-DNA復(fù)合物捕獲在DNA損傷部位，由于長期存在的PARP-DNA復(fù)合物，細胞持續(xù)存在于細胞周期中的S期，被抓捕的DNA就變成了遺傳毒性更厲害的DNA雙鏈斷裂，最終干擾DNA復(fù)制，而捕獲PARP-DNA復(fù)合物的能力與PARP抑制劑的細胞毒性有關(guān)。臨床上，PARP抑制劑可根據(jù)其捕獲PARP的能力進行排名：Talazoparib≥Niraparib>Olaparib=Rucaparib≥Veliparib[21]。這種作用機制是PARP抑制劑的臨床開發(fā)中需要考慮的因素，無論是單獨使用還是在臨床試驗中常與常規(guī)化學(xué)療法結(jié)合使用。

2.3其他 PARP抑制劑的細胞毒性是一個多階段、多步驟的過程。其能通過阻斷PARP1與環(huán)狀鳥苷一磷酸-腺苷一磷酸合酶的互相作用阻止腫瘤的發(fā)生[22]。除DNA修復(fù)和復(fù)制叉的穩(wěn)定外，PARP1還參與基因表達調(diào)控，RNA加工和核糖體的產(chǎn)生，這可能有助于抑制PARP的細胞作用[23]。有文獻報道，PARP1能夠調(diào)節(jié)與p53、核受體、核因子κB有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性[24]。因此，轉(zhuǎn)錄失調(diào)可能會使腫瘤細胞對PARP抑制劑更為敏感，如核因子κB的過度活化能通過PARP抑制劑得以減弱。此外，抑制PARP功能，將會使核仁中的DDX21泄露到細胞核中，從而減少核糖體DNA轉(zhuǎn)錄和核糖體的產(chǎn)生，最終抑制乳腺癌的生長[25]。

3 PARP抑制劑在乳腺癌中的耐藥分子機制

有研究表明，在攜帶BRCA突變的患者及小鼠模型中，BRCA突變的攜帶者對PARP抑制劑的反應(yīng)效果通常會因高耐藥率而受損[26]。此外，另一項關(guān)于BRCA突變腫瘤的研究表明，鉑類藥物的耐藥在一定程度能夠預(yù)測PARP抑制劑也會耐藥，表明它們可能具有共同的機制[27]。根據(jù)體內(nèi)和體外研究結(jié)果，現(xiàn)已確定了幾種耐藥機制，見表1。

表1 PARP抑制劑耐藥機制

3.1藥物外排蛋白的過表達 在缺乏BRCA1的乳腺癌小鼠模型中，大多數(shù)對PARP抑制劑表現(xiàn)出耐藥性的腫瘤均顯示出藥物外向轉(zhuǎn)運蛋白基因Abcb1(也稱為MDR1)編碼的P-糖蛋白過表達[28]。P-糖蛋白是ABC家族的一個成員，可轉(zhuǎn)運細胞分子、營養(yǎng)素、藥物和毒素等。文獻報道，Abcb1基因的上調(diào)會導(dǎo)致癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[29]。但研究顯示，P-糖蛋白的底物目前僅有奧拉帕尼和蘆卡帕尼，其他PARP抑制劑(如AZD2461、維利帕尼和CEP-8983)均不是P-糖蛋白的底物[30]。同時，長時間使用PARP抑制劑中的奧拉帕尼會提高小鼠癌癥模型的P-糖蛋白水平，減少細胞內(nèi)的藥物攝入、使藥物外排增加，最終引起藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥[28]。有學(xué)者在耐PARP抑制劑的人卵巢癌細胞中觀察到Abcb1的過表達，通過加用MDR1抑制劑維拉帕米共同治療可以逆轉(zhuǎn)其耐藥性[31]。然而，P-糖蛋白的過表達與PARP抑制劑的耐藥性有關(guān)尚未有充足的臨床證據(jù)。MDR1抑制劑聯(lián)合PARP抑制劑治療可能是未來的一種治療策略。

3.2PARP1和PARG蛋白的變化 PARP1和PARP2作為PARP家族中最重要的成員，也是PARP抑制劑的主要靶標(biāo)，癌細胞中PARP1表達水平的變化會導(dǎo)致PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性。在BRCA1缺失的HCC1937細胞中發(fā)現(xiàn)，PARP1表達水平的升高導(dǎo)致PARP抑制劑耐藥性的產(chǎn)生，且與乳腺癌患者的預(yù)后較差有關(guān)[32]。然而，有文獻報道，PARP抑制劑的細胞毒性遠大于PARP1基因缺失引起的細胞毒性[33]。不同PARP抑制劑抑制PARP蛋白催化活性的能力與PARP抑制劑的細胞毒性能力無關(guān)。相反，不同抑制劑在受損染色質(zhì)上捕獲PARP蛋白的能力能夠更好地預(yù)測細胞毒性[34]。在人類細胞模型中，PARP1和PARP2均被PARP抑制劑——Olaparib捕獲在染色質(zhì)上[34]。然而，由于干擾小RNA介導(dǎo)的PARP1的耗竭能夠減弱Olaparib的細胞毒性，因此有學(xué)者推斷，改變PARP1捕獲DNA的能力是PARP抑制劑耐藥的機制[31]。這與PARP1是細胞中最豐富的PARP蛋白的結(jié)果相符，且PARP1也負(fù)責(zé)90%細胞的多聚核糖基化修飾[35]。

此外，PARG的缺失和上調(diào)也是PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性的原因[36]。有研究報道，PARG的缺失部分恢復(fù)了PARP抑制劑處理細胞的多聚核糖基化修飾，減少了PARP1對DNA的捕獲，挽救了部分依賴DNA損傷信號的PARP1[37]，從而恢復(fù)了PARP1的催化活性，阻止了不受控制的復(fù)制叉進程，足以使得下游的DNA損傷相關(guān)修復(fù)蛋白得到補充，進而導(dǎo)致PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性。以上數(shù)據(jù)表明，PARP抑制劑并不能完全阻斷PARP活性，內(nèi)源性PARG活性對PARP抑制劑的細胞毒性作用也至關(guān)重要，且這種耐藥機制在BRCA2或BRCA1突變的人類細胞系中也被觀察到。

3.3HR的恢復(fù)

3.3.1BRCA1和BRCA2的重新激活 HR恢復(fù)的一個明顯機制為繼發(fā)性遺傳改變導(dǎo)致BRCA1/2功能的重新激活。研究顯示，在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌中，BRCA1/2以及RAD51C、RAD51D和PALB2等基因的許多繼發(fā)突變，即回復(fù)突變，使得閱讀框架重新開放，同時還可以恢復(fù)蛋白質(zhì)的活性[38]。有關(guān)腫瘤細胞模型的研究表明，回復(fù)突變的發(fā)生率很高，從而產(chǎn)生了對PARP抑制劑的耐藥性[39]。另有研究發(fā)現(xiàn)，回復(fù)突變通常顯示出微同源性特征，表明它們是由原始HR缺陷細胞中通過易錯修復(fù)機制修復(fù)DNA雙鏈斷裂的結(jié)果[40]。此外，這種回復(fù)突變不僅引起PARP抑制劑耐藥，還參與了其他破壞DNA藥物的耐藥。

3.3.2抑制非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ) 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)HR的第二種方法為抑制NHEJ，DNA雙鏈斷裂大部分通過3種途徑修復(fù)，即HR、NHEJ和微同源介導(dǎo)的末端連接，由于缺乏HR的細胞無法通過HR來修復(fù)DNA雙鏈斷裂，因此這些細胞中的NHEJ增加，而NHEJ缺陷的細胞會對PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性[41]。另有文獻報道，HR的恢復(fù)是由于p53結(jié)合蛋白1(p53 binding protein 1，53BP1)失活而引起，53BP1能通過遏制HR修復(fù)所需的DNA末端切除，進而促進NHEJ[42]。因此，失去53BP1功能可促進不依賴BRCA1的末端切除表現(xiàn)出對PARP抑制劑的抵抗。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，53BP1 介導(dǎo)的修復(fù)下游因子[如RIF1(Rap 1-interacting factor 1，RIF1)和病毒顆粒蛋白表達調(diào)節(jié)因子 7]的失活也導(dǎo)致DNA末端切除的恢復(fù)，從而促進了HR的修復(fù)[43]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一個名為Shieldin的53BP1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，其由病毒顆粒蛋白表達調(diào)節(jié)因子7、SHLD1、SHLD2和 SHLD3組成[44]。Shieldin可以通過限制DNA末端切除而在53BP1途徑中充當(dāng)下游效應(yīng)因子[45]。從機制上來看，Shieldin復(fù)合物直接定位于DNA雙鏈斷裂位點，其丟失會損害NHEJ并引起切除過度[41]。同時，由于HR的恢復(fù)，Shieldin 基因的突變會導(dǎo)致BRCA1缺失的細胞和腫瘤對PARP抑制劑產(chǎn)生抗性[43]。此外，Dynein輕鏈LC8型1和HELB解旋酶的失活也可以促進末端切除并恢復(fù)獨立于53BP1外的HR途徑，從而導(dǎo)致BRCA1缺陷細胞對PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性[46]。

3.4穩(wěn)定DNA復(fù)制叉 在BRCA1/2缺失的細胞中，穩(wěn)定的復(fù)制叉和HR恢復(fù)與DNA雙鏈斷裂修復(fù)有關(guān)，已成為PARP抑制劑耐藥性的替代機制。有報道稱，在BRCA1/2缺失的情況下，MRE11和MUS81等核酸酶會破壞復(fù)制叉，導(dǎo)致新生鏈縮短，復(fù)制叉塌陷和染色體畸變[47]。Zeste 2多梳抑制復(fù)合物2亞基的增強子和PTIP(PAX transcription activation domain interacting protein)分別參與將MUS81和MRE11招募到停滯的復(fù)制叉中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它們可以調(diào)節(jié)PARP抑制劑的敏感性[47]。有研究顯示，miR-493-5p通過下調(diào)MRE11和核酸外切酶1從而穩(wěn)定復(fù)制叉，表明miR-493-5p的過表達可誘導(dǎo)BRCA2突變腫瘤對PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性[48]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)ATR/CHK1軸既有助于HR恢復(fù)，也有助于BRCA缺陷細胞穩(wěn)定復(fù)制叉[49]。因此，目前正在研究使用ATR/CHK1抑制劑治療PARP抑制劑耐藥性的癌癥[49]。同時，SMARCAL1、ZRANB3和HLTF等前叉重塑因子的耗盡也會促進MRE11降解，從而降低對PARP抑制劑的敏感性[50]。

4 小 結(jié)

盡管PARP抑制劑在乳腺癌和卵巢癌的臨床試驗中取得了良好效果，但在臨床應(yīng)用開發(fā)PARP抑制劑中還存在許多的挑戰(zhàn)：①單一或聯(lián)合用藥的方式及順序；②Olaparib等藥物的水溶性低，不易通過血腦屏障；③長期治療的安全性；④明確和克服耐藥性的機制；⑤PARP抑制劑能對正常組織造成DNA積聚性的損害等。目前已知PARP抑制劑能夠抑制PARP1和PARP2，但還需要闡明它們對PARP家族其他成員的作用。因此，有必要增加PARP抑制劑對PARP1的特異性[51]。

在臨床治療中，由于PARP抑制劑的協(xié)同致死效應(yīng)與PARP-DNA捕獲理論，其為乳腺惡性腫瘤的診療提供了一個有效的治療靶標(biāo)，但對PARP抑制劑的耐藥性仍是一個需要解決的問題。其中，HR的恢復(fù)與穩(wěn)定的復(fù)制叉作為PARP抑制劑重要的耐藥機制，有待進一步的研究。雖然目前已對PARP抑制劑的耐藥性進行了深入研究，并揭示了不同的機制，但仍需要系統(tǒng)和全面的臨床試驗來開發(fā)克服PARP抑制劑耐藥的新策略。