藁本內(nèi)酯抗藥物誘導(dǎo)的斑馬魚血栓的作用研究

唐惠蘭，李姍姍，袁佩靈，江 焱，唐嬌嬌，林翰文，胡 光

(重慶理工大學(xué) 藥物化學(xué)與分子藥理學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400054)

1 研究背景

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在全球所有的致死病因中，由心腦血管疾病引起的死亡數(shù)量排第一位，全球每年死于心腦血管疾病的人數(shù)約有1 750萬[1]；在我國，每年的死亡人數(shù)高達260萬左右，發(fā)病率在0.38%～10%[2]。血栓(血管內(nèi)皮表面形成的塊狀物)是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要病因，誘發(fā)血栓形成的主要因素有原發(fā)性因素和繼發(fā)性因素2種。動脈血栓的形成多為血小板活化和發(fā)生聚集反應(yīng)，而深靜脈血栓是靜脈血栓常見的癥狀，其形成機制主要是血管壁異常、血流變緩或減少、促血栓形成因子增加等[3]。

近年來，關(guān)于抗血栓性疾病藥物的基礎(chǔ)性研究中，基于動物實驗平臺探究深靜脈血栓的形成是一種常見的研究方法，主要用來進行抗血栓藥物的篩選。目前，關(guān)于抗血栓藥物的開發(fā)，抗血小板聚集藥物、抗凝血藥物和溶血栓藥物是3個常見的藥物開發(fā)種類及研究方向。已上市的抗血栓類西藥主要有阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛等，其中阿司匹林是第一代抗血小板聚集藥，具有較為穩(wěn)定的抗血栓活性，常在實驗中被用作抗血栓研究的陽性對照藥。而中藥研究中常見的抗血栓藥物主要包括丹參、水蛭、當(dāng)歸、虎杖、川芎、郁金、延胡索、紅花、三棱、莪術(shù)等。藁本內(nèi)酯(ligustilide，LIG，其結(jié)構(gòu)式如圖1)是當(dāng)歸的主要活性成分，研究顯示，它能很好地改善血液微循環(huán)，有助于平滑肌運動，抑制血管新生[4]，在整個心腦血管及循環(huán)系統(tǒng)中能發(fā)揮較強的藥理作用，是典型的抗栓藥物之一。

圖1 藁本內(nèi)酯(LIG)結(jié)構(gòu)式

斑馬魚是繼大鼠和小鼠后的世界第三大模式動物，其基因測序已基本完成，被廣泛地應(yīng)用于各種體內(nèi)(in vivo)實驗的研究。傳統(tǒng)的深靜脈血栓形成研究通常以家兔、犬等動物為對象，對其組織器官進行病理學(xué)分析。與傳統(tǒng)的動物試驗?zāi)Ｐ拖啾?，斑馬魚具有體積小、預(yù)測性好、實驗成本低、周期短、可比度高等優(yōu)勢；此外，斑馬魚與人類基因組的同源程度高[5-6]，在基因水平上，與人類基因組可以達到87%的相似度[7-8]，在胚胎早期的心血管系統(tǒng)的發(fā)育和人類極其相似，且與人類血液系統(tǒng)的凝血因子和血小板有諸多共同點[9-10]，因此用斑馬魚進行試驗可以模擬人類血栓的發(fā)病過程，得到的結(jié)果在一定程度上適用于人體。當(dāng)前對于斑馬魚血栓模型的研究中，以尾靜脈部位的血栓構(gòu)建為主，同時利用拍照、軟件處理等方法進行結(jié)果分析[11]。

綜上所述，采用斑馬魚胚胎構(gòu)建藥物誘導(dǎo)的血栓模型并對相應(yīng)的評價方法加以優(yōu)化，能夠為后續(xù)的藥物開發(fā)提供高通量篩選的實驗平臺。本研究在優(yōu)化了相應(yīng)誘導(dǎo)劑給藥參數(shù)的基礎(chǔ)上，以阿司匹林為陽性對照藥，研究了LIG的斑馬魚體內(nèi)抗血栓作用，為抗血栓體內(nèi)模型的開發(fā)及LIG的抗血栓活性驗證提供了數(shù)據(jù)參考。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗動物

實驗用斑馬魚購自上海費曦生物科技有限公司，品系為野生型AB系，飼養(yǎng)于本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中。成年斑馬魚的養(yǎng)殖方法參照國家斑馬魚資源中心(CZRC)的相關(guān)規(guī)定，環(huán)境溫度控制在25～28 ℃，光照時間為14 h，黑暗時間為10 h。產(chǎn)卵雌魚和雄魚比為1∶2。

2.2 主要試劑和儀器

LIG，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；苯肼(PH)、(±)-腎上腺素鹽酸鹽(AH)、3-3’-二甲氧基聯(lián)苯胺、阿司匹林購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；全自動智能型霉菌培養(yǎng)箱；尼康E100雙目光學(xué)顯微鏡；Olympus正置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)。

2.3 鄰聯(lián)茴香胺染色方法

用3-3′二甲氧基聯(lián)苯胺、無水乙醇、雙氧水、無水乙酸鈉配制鄰聯(lián)茴香胺染色液，斑馬魚胚胎經(jīng)過誘導(dǎo)劑和給藥處理后，轉(zhuǎn)移至鄰聯(lián)茴香胺染色液中避光染色一定時間(不同染色時間見表2、4)，染色處理完成后吸出染色液，用適量DMSO迅速清洗3次，在熒光顯微鏡下拍照并保存圖片。

2.4 PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗考察分析，設(shè)計正交實驗優(yōu)化PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型的4個相關(guān)參數(shù)：PH濃度、誘導(dǎo)時間、染色時間、魚齡。4個參數(shù)的具體選擇情況如表1所示：PH的濃度水平為0.75、1.5、3.0 μmol/L，血栓誘導(dǎo)時間水平為18、24、30 h；鄰聯(lián)茴香胺染液染色時間為25、30、35 min；魚齡水平為2、3、4 dpf。在斑馬魚胚胎發(fā)育至1 dpf時，向斑馬魚胚胎培養(yǎng)皿中加入0.2 mmol/L的1-苯基-2硫脲(PTU)處理24 h以抑制黑色素形成。在培養(yǎng)環(huán)境下選取生理狀況正常、活潑性好的幼魚進行實驗，并將其隨機放置于24孔板中，每孔放置10條，設(shè)置1個空白組(胚胎培養(yǎng)水)、1個溶劑組(0.1 %乙醇)、9個正交設(shè)計實驗組，取不同親本斑馬魚重復(fù)實驗3次，正交實驗組設(shè)計如表2所示。

表1 PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實驗因素水平表

表2 PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實驗設(shè)計表

2.5 AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化

AH正交實驗方法采用與2.4節(jié)中類似的實驗設(shè)計，選取AH濃度為7.5、15、30 μmol/L；血栓誘導(dǎo)時間為12、16、20 h；鄰聯(lián)茴香胺染液染色時間為25、30、35 min；斑馬魚的不同魚齡為2、3、4 dpf，如表3所示。正交實驗四因素三水平表設(shè)計如表4所示。

表3 AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實驗因素水平表

表4 AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的正交實驗設(shè)計表

2.6 LIG對斑馬魚血栓的作用探究

2.6.1LIG對PH誘導(dǎo)斑馬魚血栓的干預(yù)

在向1 dpf的斑馬魚胚胎加入0.2 mmol/L的PTU處理1 d后，選取生理狀況、活動狀況優(yōu)良的2 dpf幼魚胚胎，隨機放置于24孔板中，每組10條。設(shè)置6個實驗組：空白對照組，誘導(dǎo)劑(PH)組，陽性對照(PH+阿司匹林)組，LIG藥物組(PH+20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L LIG)。其中，在斑馬魚處于48 hpf時，誘導(dǎo)劑組用0.75 μmol/L苯肼誘導(dǎo)24 h，陽性對照組于42 hpf時，加入22.5 mg/L阿司匹林6 h，再用苯肼誘導(dǎo)24 h；LIG藥物組在27 hpf時給藥21 h后，再用苯肼誘導(dǎo)24 h。取不同親本幼魚重復(fù)試驗3次，拍照保存染色結(jié)果圖。

2.6.2LIG對AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓的干預(yù)

實驗方法與2.6.1中的類似，設(shè)置6個實驗組：空白對照組，誘導(dǎo)劑(AH)組，陽性對照(AH+阿司匹林)組，LIG藥物組(AH+20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L LIG)。其中，在斑馬魚處于48 hpf時，誘導(dǎo)劑組用15 μmol/L鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)16 h；陽性對照組處于42 hpf時，加入22.5 mg/L阿司匹林6 h后，用鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)16 h；LIG藥物組在27 hpf時，給藥21 h后用鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)16 h，其余實驗操作方法與2.6.1相同。

2.7 實驗數(shù)據(jù)的處理

尾部血栓定量分析：藥物誘導(dǎo)使斑馬魚尾部血流發(fā)生聚集現(xiàn)象，因而生成血栓；采用Image-Pro Plus 6.0軟件對已拍照的圖片進行尾部染色面積計算，通過尾部染色面積S定量分析血栓形成情況；統(tǒng)計學(xué)結(jié)果需采用SPSSAU project(2020)進行數(shù)據(jù)的處理和分析，2組實驗數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間比較用方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型參數(shù)優(yōu)化的結(jié)果

3.1.1PH正交實驗

對PH的正交實驗數(shù)據(jù)進行極差分析，如表5所示，極差：誘導(dǎo)時間>染色時間>PH濃度>魚齡，說明PH誘導(dǎo)時間對斑馬魚尾部血栓形成具有最重要的影響，其次是染色時間，而PH濃度和魚齡對尾部血栓的影響較小且兩者比較接近。根據(jù)表中均值K的數(shù)據(jù)可知，PH誘導(dǎo)的最優(yōu)條件為PH濃度0.75 μmol/L，誘導(dǎo)時間24 h，染色時間35 min，魚齡2 dpf。

表5 PH正交實驗結(jié)果

3.1.2AH正交實驗

對AH正交實驗結(jié)果所得數(shù)據(jù)的極差分析可得，極差：魚齡>AH濃度>誘導(dǎo)時間>染色時間，即影響斑馬魚血栓形成的主要因素是魚齡和AH濃度，染色時間和誘導(dǎo)時間次之。根據(jù)各因素的均值K可知，AH最佳誘導(dǎo)條件是濃度15 μmol/L，誘導(dǎo)時間16 h，染色時間30 min，魚齡4 dpf，如表6所示。

表6 AH正交實驗結(jié)果

3.2 LIG抑制斑馬魚血栓形成的實驗結(jié)果

3.2.1以PH為誘導(dǎo)劑的實驗結(jié)果

如圖2所示，與空白對照組相比，誘導(dǎo)劑組心臟染色強度降低而尾部染色增強，說明尾部血流出現(xiàn)聚集現(xiàn)象而形成血栓，PH試劑誘導(dǎo)斑馬魚血栓建模成功；由統(tǒng)計學(xué)分析(圖3)可知，陽性對照組及20 μmol/L與40 μmol/L的LIG給藥組的斑馬魚尾部染色強度與誘導(dǎo)劑組相比，都呈現(xiàn)出了顯著差異(P<0.05)，說明阿司匹林和20 μmol/L與40 μmol/L的LIG能夠有效降低PH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓形成；60 μmol/L的LIG給藥組與誘導(dǎo)劑組相比沒有顯著性差異。具體情況如下：加入阿司匹林的陽性對照組比誘導(dǎo)劑組的尾部染色面積小，且心臟染色面積有部分增加；加入LIG的給藥組與誘導(dǎo)劑組相比，20 μmol/L和40 μmol/L的LIG能明顯(P<0.001)減少斑馬魚尾部血栓形成的面積，心臟染色面積明顯增強；20 μmol/L和40 μmol/L LIG給藥組2組間抗血栓效果無明顯差異；而60 μmol/L LIG給藥組與誘導(dǎo)劑組相比，斑馬魚尾部血栓形成的面積沒有顯著性差異。此外，實驗結(jié)果顯示LIG 20 μmol/L和40 μmol/L給藥組的尾部血栓面積也顯著性低于陽性對照組，但由于LIG與阿司匹林的給藥濃度、時長等參數(shù)不同，所以無法進一步比較哪種藥物抑制斑馬魚尾部血栓面積效果更好。綜上所述，20 μmol/L和40 μmol/L LIG能夠顯著降低PH誘導(dǎo)的斑馬魚尾部血栓形成。圖2中(A1)～(A4)分別為空白對照組，PH誘導(dǎo)劑組，陽性對照組，40 μmol/L LIG給藥組；(B1)～(B4)分別為空白對照組，PH誘導(dǎo)劑組，陽性對照組，40 μmol/L LIG給藥組。

圖2 PH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型各組染色效果圖

注：與誘導(dǎo)劑組相對比，***P<0.001；與陽性對照組相比，ΔΔP<0.01

3.2.2以AH為誘導(dǎo)劑的實驗結(jié)果

如圖4所示，與空白對照組相比，誘導(dǎo)劑組的斑馬魚心臟染色強度降低而尾部染色增強，說明在斑馬魚尾部形成血栓，AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型建模成功；同3.2.1統(tǒng)計學(xué)方法分析(圖5)，陽性對照組及20 μmol/L與40 μmol/L的LIG給藥組的斑馬魚尾部染色強度與誘導(dǎo)劑組相比，都呈現(xiàn)出了顯著性差異(P<0.05)，說明阿司匹林和20 μmol/L與40 μmol/L的LIG都能有效降低AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓形成。

注：與誘導(dǎo)劑組相比，***P<0.001；與陽性對照組相比，ΔP<0.05

圖4 AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型各組染色效果圖

具體情況如下：加入阿司匹林的陽性對照組比誘導(dǎo)劑組的斑馬魚尾部染色面積小，心臟染色面積增加；加入LIG的給藥組與誘導(dǎo)劑組相比，20 μmol/L和40 μmol/L的LIG給藥組能顯著(P<0.001)減少斑馬魚尾部的血栓形成面積，增加心臟染色面積，而20 μmol/L和40 μmol/L LIG給藥組之間抗血栓效果并無顯著性差異；60 μmol/L LIG給藥組與誘導(dǎo)劑組相比無顯著性差異。此外，實驗結(jié)果顯示:40 μmol/L的LIG給藥組的尾部血栓面積顯著(P<0.05)低于陽性對照組，但由于LIG與阿司匹林的給藥濃度、時長等參數(shù)不同，所以無法進一步比較在該模型中哪種藥物抑制斑馬魚尾部血栓面積效果更好。綜上所述，20 μmol/L和40 μmol/L LIG在AH誘導(dǎo)的斑馬魚血栓模型中，能顯著抑制血栓的形成。(A1)～(A4)分別為空白對照組，AH誘導(dǎo)劑組，陽性對照組，40 μmol/L LIG給藥組；(B1)～(B4)分別為空白對照組，AH誘導(dǎo)劑組，陽性對照組，40 μmol/L LIG給藥組。

4 討論

本實驗采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)法，利用PH的強氧化作用[12]對血管造成損傷和AH的刺激血小板高度異常聚集作用[13]，誘導(dǎo)斑馬魚血栓的形成，并在4 d內(nèi)完成藥物的抗血栓作用。實驗所用斑馬魚魚齡小、藥物吸收快、觀察方便，相較于在傳統(tǒng)大型實驗動物上采用物理、化學(xué)等方法建立血栓模型而言，血栓形成時間更短，節(jié)約研究時間。

在實驗過程中，可以觀察到加入誘導(dǎo)劑后的斑馬魚活動狀態(tài)逐漸變差，心臟血流速度減緩；由斑馬魚血栓模型誘導(dǎo)參數(shù)結(jié)果分析可知，PH誘導(dǎo)18 h、AH誘導(dǎo)12 h時，在顯微鏡下能直接觀察到斑馬魚尾部有明顯的血栓形成，且隨著誘導(dǎo)時間的增加，血栓形成數(shù)量先增加后減少，心臟染色強度與尾部血栓形成情況相反[14]，這與國家專利(國家專利號：201110126427.2)報道的結(jié)果相符[15]。在預(yù)實驗中，通過對PH和AH誘導(dǎo)濃度的篩選試驗結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)部分較高濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血栓形成效果不及較低濃度，如0.75 μmol/L的PH誘導(dǎo)效果優(yōu)于3 μmol/L的PH誘導(dǎo)效果，15 μmol/L的AH誘導(dǎo)效果比30 μmol/L誘導(dǎo)效果更好，這些都可能與誘導(dǎo)劑濃度過高可能引起斑馬魚生理狀態(tài)大幅改變相關(guān)。

本課題組還在預(yù)實驗中對PTU的給藥時長進行了考察，即在加入PTU后，觀察斑馬魚表面黑色素抑制的恢復(fù)情況。96 hpf時，黑色素基本沒有恢復(fù)，104 hpf時，在魚的第一背鰭和第二背鰭附近開始有明顯的黑色素恢復(fù)，120 hpf時，在魚的背部生成大面積黑色素。因此實驗中選用的斑馬魚胚胎不宜超過4 dpf，以減輕黑色素的恢復(fù)對實驗觀察的影響，這也是本研究在AH誘導(dǎo)斑馬魚血栓模型組的正交實驗設(shè)計優(yōu)化參數(shù)中，雖然得到了魚齡為4 dpf為最優(yōu)參數(shù)，但在LIG的給藥實驗中，依然選擇在2 dpf附近的時期進行給藥的原因之一；另一個原因是考慮到斑馬魚作為高通量篩選模型，時間短、篩選效率高，因此最后還是選擇了2 dpf左右作為實際LIG的給藥處理時期，以縮短試驗周期，體現(xiàn)高通量的特色。

LIG能對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生保護作用[16]，因此針對本實驗2種誘導(dǎo)劑構(gòu)建的血栓模型能產(chǎn)生一定作用效果。據(jù)有關(guān)報道，LIG在10 μmol/L的低濃度下作用效果不佳，而80 μmol/L濃度時對斑馬魚會產(chǎn)生一定毒性，100 μmol/L濃度就能抑制魚卵孵化、影響魚體形態(tài)發(fā)育[17]。在本實驗中，20 μmol/L和40 μmol/L LIG對斑馬魚尾部血栓有顯著抑制作用，然而在濃度為60 μmol/L時，有些斑馬魚已經(jīng)開始出現(xiàn)游動緩慢、尾巴彎曲、心臟水腫，甚至死亡等現(xiàn)象(死亡率30%～40%)，體現(xiàn)出了較大的毒性作用，這也可能是由于60 μmol/L的LIG的抗血栓效果不如20、40 μmol/L的LIG。

綜上所述，本研究采用PH和AH通過損傷斑馬魚血管內(nèi)皮表面誘導(dǎo)血栓模型，通過正交實驗設(shè)計找到了建立模型的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、染色時間、魚齡的最佳參數(shù)；同時通過該模型發(fā)現(xiàn)20 μmol/L和40 μmol/L的LIG在斑馬魚體內(nèi)具有一定的抗血栓效果，對采用斑馬魚模型評價藥物的抗血栓活性及LIG的體內(nèi)抗血栓研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持。