邱穎萍，牛國楨，劉春雨，邵玉婷，畢燕龍

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科，上海 200065)

先天性遺傳性角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(congenital hereditary endothelial dystrophy，CHED)是一種罕見的角膜內(nèi)皮遺傳性疾病，以雙側(cè)彌漫性角膜水腫和混濁為特征，可在生命早期出現(xiàn)不同程度的視力損傷[1]。目前角膜移植術(shù)是其唯一有效的治療方法[2-3]，但全球角膜供體的緊缺、手術(shù)并發(fā)癥和手術(shù)技術(shù)難度大等限制了該方法的普及，尋求非侵入性的治療干預(yù)新靶點(diǎn)具有重要意義[4]。SLC4A11作為碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一種跨膜蛋白[5]，其突變可導(dǎo)致CHED和Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs’ endoth-elial corneal dystrophy, FECD)的發(fā)生[6-8]。SLC-4A11作為一種分子泵作用于角膜內(nèi)皮，可以促進(jìn)水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、Na+/OH-共轉(zhuǎn)運(yùn)、Na+非依賴的H+(OH-)轉(zhuǎn)運(yùn)和NH3的轉(zhuǎn)運(yùn)[9-10]，對防止角膜水腫，維持角膜穩(wěn)態(tài)起到重要作用。研究表明SLC4A11缺失與氧化損傷和凋亡的敏感性增加有關(guān)[11-12]。自噬是細(xì)胞在壓力條件下通過降解胞漿成分維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種高度保守的細(xì)胞機(jī)制。病理?xiàng)l件下，自噬功能受損將會導(dǎo)致線粒體受損，增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，參與角膜營養(yǎng)不良等多種疾病的發(fā)病過程[13]。目前有關(guān)SLC4A11的具體生理作用及其在角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良中的作用機(jī)制尚不清楚，成為近年來的研究熱點(diǎn)。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除C57BL/6J小鼠Slc4a11基因，觀察基因敲除后小鼠角膜的變化，同時探究Slc4a11基因缺失在CHED發(fā)病過程中對自噬的潛在調(diào)控作用機(jī)制，以期為角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良性疾病的發(fā)病機(jī)制和防治方法提供新的研究思路和干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

質(zhì)粒px330-Cas9購自Addgene公司；MEGAsh-ortscriptTMT7 Transcription Kit、mMESSAGE mM-ACHINE T7 Kit購自美國Life Technologies公司；TRIeasyTMTotal RNA Extraction Reagent、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix購自上海翊圣生物科技有限公司；SLC4A11抗體購自美國Signalway Antibody公司；鼠尾基因型快速鑒定試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體購自美國Proteintech公司；LC3抗體、p62抗體、Beclin1抗體購自英國Abcam公司；顯微鏡型號購自德國Leica公司。

1.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建和繁殖

針對C57BL/6J小鼠Slc4a11基因內(nèi)含子8和內(nèi)含子13設(shè)計(jì)2條sgRNA，sgRNA1：5′-CAGCAT-TTGCCAGGGATGCA-3′和sgRNA2：5′-CTGTTG-CAGTGAGCAAGTTC-3′。根據(jù)sgRNA結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)sgRNA PCR擴(kuò)增上游引物Slc4a11sgRNA1，Slc4a11sgRNA2，下游引物T7SG-LW，見表1。利用MEGA shortscriptTMT7 Transcription Kit體外轉(zhuǎn)錄sgRNA。以px330-Cas9為模板，利用引物T7Cas9-F和T7Cas9-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見表1。利用mMESSAGE mMA-CHINE T7 kit體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA。將轉(zhuǎn)錄好的sgRNA和Cas9 mRNA混合并調(diào)整濃度至50 ng/μL，顯微注射法注入C57BL/6J小鼠(購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司)受精卵胞質(zhì)中，再植入假孕小鼠體內(nèi)，繁殖得到F0代小鼠。將基因敲除陽性的F0代小鼠經(jīng)過兩代繁育后獲得F2代小鼠。選取F2代中指定年齡的基因敲除純合子小鼠(knockout, KO)和C57BL/6J野生型小鼠(wild type, WT)作為實(shí)驗(yàn)對象，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 基因型鑒定

剪取0.2～1 cm的小鼠尾尖，使用鼠尾基因型快速鑒定試劑盒提取基因組DNA，作為PCR模板。鑒定所需PCR擴(kuò)增引物包括突變型鑒定引物Slc4a11Outer check 2F、Slc4a11Outer check 2R，野生型鑒定引物Slc4a11-del-check-F、Slc4a11-del-check-R，見表1。利用PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，取5 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，部分產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序。

表1 引物名稱及其序列

1.4 角膜內(nèi)皮茜素紅染色

取20周小鼠，WT組和KO組各3只。在顯微鏡下剪取小鼠角膜組織，內(nèi)皮面朝上放置于載玻片上，0.2%茜素紅染液(pH 4.2)染色90 s，1×PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定10 min，洗滌后蓋上蓋玻片，顯微鏡拍照觀察。每個角膜在顯微鏡下隨機(jī)選取5個不重復(fù)的0.1 mm×0.1 mm正方形區(qū)域，用Image J圖像處理軟件評估CECs的密度和面積。

1.5 眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描(anterior segment optical coherence tomography, AS-OCT)

取10、20、30周小鼠，每個年齡段的WT組小鼠和KO組小鼠各3只。所有操作均由同1名有經(jīng)驗(yàn)的技師完成。應(yīng)用德國Zeiss公司AS-OCT對小鼠進(jìn)行眼前節(jié)的照相，測量中央角膜厚度。每只眼測3次，取平均值。

1.6 角膜組織切片H-E染色

取10周的WT和KO小鼠眼球各3只，浸于10%酸性甲醛中固定48 h，常規(guī)脫水，將眼球沿矢狀位方向剖為3個部分，取中間部分進(jìn)行乙醇逐級脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，行H-E染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察角膜組織形態(tài)、采集圖像，利用Case Viewer 2.2軟件測量角膜中央厚度，每張圖像測3次，取平均值。

1.7 RT-qPCR及Western印跡法檢測

取10、30周的WT和KO小鼠各3只，分離出小鼠角膜的后彈力層和角膜內(nèi)皮，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因相對表達(dá)量。引物序列見表2。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃變性10 s，60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。

表2 RT-qPCR的引物名稱及其序列

取10、30周的WT和KO小鼠各3只，將分離出的后彈力層和角膜內(nèi)皮組織勻漿后，提取并測定總蛋白濃度。各樣本等質(zhì)量等體積上樣，80 V恒壓電泳。200 mA濕轉(zhuǎn)120 min，無蛋白快速封閉液封閉10 min，TBST洗膜3次，加入抗Slc4a11、LC3、Beclin1、p62、β-actin(1∶1 000)等一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育2 h，洗膜，加入顯影劑，于凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測蛋白表達(dá)。

1.8 透射電子顯微鏡

將各組角膜樣本置于2.5%的戊二醛溶液，4 ℃固定過夜，再于1%鋨酸中進(jìn)行二次固定。經(jīng)漂洗后進(jìn)行梯度乙醇逐級脫水。將角膜浸入環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋，之后進(jìn)行半薄切片，切片厚度為1 μm，天青藍(lán)染色后光鏡下觀察。然后進(jìn)行超薄切片，厚度為80 nm，收集于銅網(wǎng)上。用檸檬酸鉛染色液染色15 min，透射電鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Slc4a11基因敲除小鼠的驗(yàn)證

應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除Slc4a11基因外顯子9-13，獲得Slc4a11基因敲除小鼠。部分F2代小鼠基因型鑒定結(jié)果見圖1，包含Slc4a11+/-(出現(xiàn)589 bp突變型條帶和469 bp野生型條帶)、Slc4a11+/+(只出現(xiàn)469 bp野生型條帶)和Slc4a11-/-(只出現(xiàn)589 bp突變型條帶)3種基因型。Slc4a11-/-小鼠的DNA測序結(jié)果顯示有2 100 bp堿基的缺失，外顯子9-13被敲除，見圖1。在Slc4a11-/-小鼠角膜內(nèi)皮組織中未檢測到SLC4A11蛋白和mRNA的表達(dá)，見圖2，表明小鼠角膜內(nèi)皮組織中Slc4a11基因被成功敲除。

圖1 Slc4a11敲除小鼠F2代仔鼠20～31號基因型鑒定結(jié)果及DNA測序峰圖

圖2 Slc4a11+/+和Slc4a11-/-小鼠角膜內(nèi)皮中SLC4A11蛋白(A)和mRNA(B)的表達(dá)

2.2 Slc4a11基因敲除對小鼠角膜表型的改變

2.2.1 角膜內(nèi)皮茜素紅染色 20周的KO小鼠CECs密度明顯小于相同年齡的WT小鼠[(2 767±63)vs(3 252±193)cells/mm2],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時CECs面積明顯大于WT小鼠[(242.7±5.0)vs(188.0±13.5)μm2，]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 WT和KO小鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞茜素紅染色

2.2.2 AS-OCT AS-OCT結(jié)果顯示W(wǎng)T組小鼠角膜厚度隨著年齡的增長呈相對穩(wěn)定的趨勢，而KO組小鼠角膜厚度隨著年齡的增長而進(jìn)行性增厚；同時相同年齡的KO小鼠角膜厚度要明顯大于WT小鼠[10周：(100.0±10.0)vs(136.7±5.8)μm;20周：(100.0±10.0)vs(163.3±5.8)μm，30周：(103.3±5.8)vs(176.7±5.8)μm]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 WT和KO小鼠的AS-OCT檢測結(jié)果

2.2.3 H-E染色和透射電鏡 H-E染色顯示W(wǎng)T小鼠角膜組織結(jié)構(gòu)完整，各層結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)層纖維排列規(guī)整，CECs呈單層扁平狀，無明顯水腫。相較于WT小鼠，KO小鼠角膜厚度明顯增加[(84.4±5.8)vs(127.4±13.4)μm]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時可見基質(zhì)層水腫，厚度增加，基質(zhì)層纖維排列欠規(guī)則，纖維裂隙增多；以及CECs明顯水腫，出現(xiàn)大量空泡樣改變，見圖5。透射電鏡同樣顯示KO小鼠出現(xiàn)CHED特征的角膜病理改變，包括：角膜后彈力層增厚；CECs增大；CECs出現(xiàn)空泡化改變等，見圖6。

圖5 10周齡的WT和KO小鼠角膜組織H-E染色

圖6 10周齡和20周齡WT和KO小鼠角膜組織透射電鏡圖像

2.3 Slc4a11基因敲除對小鼠角膜內(nèi)皮自噬信號通路的影響

RT-qPCR檢測自噬信號通路相關(guān)因子顯示，在10周和30周的小鼠角膜內(nèi)皮中，相較于同年齡WT組，KO組自噬相關(guān)因子LC3、Beclin1的表達(dá)明顯升高，p62表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

Western印跡法檢測同樣顯示，在10周和30周的小鼠角膜內(nèi)皮中，相較于同年齡WT組，KO組自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表達(dá)明顯升高，p62表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 Slc4a11敲除對小鼠角膜內(nèi)皮自噬相關(guān)因子表達(dá)水平的影響

透射電鏡顯示10、20周的KO小鼠CECs內(nèi)均可見自噬體及其吞噬的內(nèi)容物，而WT小鼠CECs內(nèi)很少能觀察到自噬體結(jié)構(gòu)，見圖6。

3 討 論

2006年，Vithana等[14]指出位于染色體20p13區(qū)域的Slc4a11基因突變導(dǎo)致了CHED的發(fā)生。Slc4a11突變通過多種方式引起CHED的發(fā)病。Slc4a11突變造成SLC4A11蛋白分子錯誤折疊，使其滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無法到達(dá)質(zhì)膜實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，抑或突變蛋白雖可以到達(dá)細(xì)胞表面，但未攜帶某些功能結(jié)構(gòu)，仍無法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)功能[4,15]。目前有關(guān)SLC4A11在CHED發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除小鼠Slc4a11基因，在動物模型上探究SLC4A11在角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良發(fā)病過程中的作用及相關(guān)機(jī)制。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除小鼠Slc4a11基因外顯子9-13，結(jié)果顯示KO小鼠顯現(xiàn)出與CHED相似的表型特征，包括角膜厚度增厚、基質(zhì)層水腫和膠原纖維排列紊亂、后彈力層增厚、CECs增大和空泡化改變。本研究中20周的KO小鼠的CECs密度相較于WT小鼠明顯減小，同時CECs面積明顯增大。這說明CECs損傷和凋亡的出現(xiàn)早于Han等[16]報(bào)導(dǎo)的40周。這是由于Slc4a11缺失激活凋亡通路，從而抑制角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長并降低其活力[17-18]。近來有研究指出，SLC4A11作為一種細(xì)胞黏附分子，增強(qiáng)了角膜內(nèi)皮細(xì)胞對后彈力層的黏附作用，因此，Slc4a11的缺失會減弱這種黏附作用，使角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少[19]。

Slc4a11基因缺失通過誘導(dǎo)小鼠角膜的病理改變成功模擬出與CHED相似的疾病表征，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究Slc4a11缺失在CHED發(fā)病中的潛在致病機(jī)制。FECD患者角膜內(nèi)皮組織中，線粒體自噬水平的上調(diào)導(dǎo)致功能性線粒體數(shù)量的減少。降低自噬流水平可能對FECD患者具有治療作用[14]。Choi等[13]指出自噬功能缺陷可能在顆粒狀角膜營養(yǎng)不良2型的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用?？梢钥闯?，自噬活動在相關(guān)的角膜病變發(fā)揮著重要作用[20]。因此，Slc4a11基因缺失是否通過影響機(jī)體的自噬活動導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，相較于同年齡的WT小鼠，KO小鼠角膜內(nèi)皮中的自噬相關(guān)因子LC3、Beclin1表達(dá)上升，而p62表達(dá)下降。以上結(jié)果表明Slc4a11的敲除使小鼠角膜內(nèi)皮組織的自噬水平顯著升高。Slc4a11基因缺失可能通過增強(qiáng)機(jī)體自噬水平誘導(dǎo)CHED的發(fā)生發(fā)展。Guha等[21]發(fā)現(xiàn)在Slc4a11敲除的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞模型中，在氧化應(yīng)激存在的情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS的生成增多，角膜內(nèi)皮細(xì)胞活力減低。同時，Slc4a11敲除的角膜內(nèi)皮細(xì)胞和CHED患者的角膜內(nèi)皮組織都出現(xiàn)Nrf2及Nrf2下游抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的下降。這些結(jié)果表明Nrf2信號通路及氧化應(yīng)激同樣參與了CHED的發(fā)病過程。而自噬通過自噬特異底物p62又與Nrf2信號通路密切聯(lián)系，p62的累積可以激活Nrf2信號通路，上調(diào)下游抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，在角膜和視網(wǎng)膜等病變中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)導(dǎo)角膜緣干細(xì)胞可以通過自噬-Nrf2-ARE信號通路更加嚴(yán)格地調(diào)控細(xì)胞氧化還原反應(yīng)[22]。同時有研究指出FECD患者角膜內(nèi)皮中DJ-1和Nrf2相關(guān)抗氧化蛋白表達(dá)量的下降可能與自噬水平的改變有關(guān)[23]。由此推測，在CHED的發(fā)病過程中，Slc4a11的缺失導(dǎo)致自噬水平上調(diào)，引起自噬降解底物p62水平的下降，減弱了由p62介導(dǎo)的對Nrf2信號通路的激活作用，從而使抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷與凋亡。以上有關(guān)Slc4a11與自噬以及Nrf2信號通路在角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良中的具體作用關(guān)系，本課題組將進(jìn)一步研究和證實(shí)。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Slc4a11基因敲除小鼠模型[24]，并證實(shí)該基因敲除小鼠模型具有與CHED相似的表型特征，為今后將其作為探究Slc4a11在CHED發(fā)病中的作用機(jī)制及治療策略的實(shí)驗(yàn)工具提供了理論上的支持。同時，本研究發(fā)現(xiàn)在Slc4a11基因敲除小鼠的角膜內(nèi)皮組織中存在自噬水平升高的現(xiàn)象，Slc4a11與自噬以及Nrf2信號通路可能在CHED的發(fā)病過程中共同發(fā)揮調(diào)控作用，靶向這些過程可能可以為治療CHED提供新的研究思路和靶點(diǎn)。