王萍，鄭晨飛，王嬌，胡璋健，邵淑君，師愷

番茄轉錄因子SlNAC29在調控植株衰老中的作用及機理

王萍，鄭晨飛，王嬌，胡璋健，邵淑君，師愷

浙江大學農業(yè)與生物技術學院，杭州 310058

【背景】番茄（）作為連續(xù)發(fā)芽分化和坐果的重要園藝作物，早衰是限制其生長期長短、產(chǎn)量和品質的重要因素。NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）轉錄因子家族參與調控擬南芥、水稻等多種植物衰老進程，但在番茄中的研究尚不深入。目前已知，SlNAP2（NAC-like, activated by apetala3/pistillata）參與番茄植株衰老進程?！灸康摹繛榈耐椿?，對其在番茄植株衰老中的功能及調控機制進行研究，以期為園藝栽培中番茄的衰老調控及種質創(chuàng)新提供科學依據(jù)?！痉椒ā恳砸吧头眩╟ondine red，CR）為背景，采用qRT-PCR技術明確在不同衰老階段葉片中的相對表達量，并分別利用CRISPR/Cas9基因編輯技術和基因過表達技術構建純合突變體及OE:穩(wěn)定過表達植株。在此基礎上，在自然生長狀態(tài)下和黑暗處理誘導衰老條件下，對野生型、突變體和OE:過表達植株的生長、葉綠素含量、光合作用、葉片衰老和葉綠素降解相關基因的相對表達量等參數(shù)進行分析，明確SlNAC29轉錄因子在調控番茄植株衰老中的生物學功能；進一步利用聚類熱圖分析過表達植株OE:中29個衰老相關基因、葉綠素降解基因以及ABA合成/信號轉導相關基因的相對表達量。并選取在黑暗誘導衰老條件下不同株系植株中表達差異明顯的4個基因進行凝膠遷移阻滯分析（electrophoretic mobility shift analysis，EMSA），以鑒定SlNAC29直接轉錄調控的靶標基因及其與衰老調控的關系。【結果】在初老葉和衰老葉片中的相對表達量較嫩葉和成熟葉顯著上升。自然生長狀態(tài)下，突變體材料與野生型長勢以及光合速率無明顯差異，而過表達材料OE:株高則顯著低于野生型植株，葉綠素含量和光合速率分別是野生型植株的25%和50%。在黑暗誘導衰老的條件下，野生型植株葉片明顯變黃，葉綠素含量顯著下降。突變緩解了葉片衰老程度，葉片無明顯變黃，葉綠素含量是野生型的3倍，衰老相關基因（senescence-associated genes，SAGs）和葉綠素降解基因的表達量均較低。OE:則相反，葉片衰老程度比野生型和突變體均明顯嚴重?；蚓垲惙治霰砻鞫鄠€衰老相關基因和葉綠素降解基因在OE:植株中顯著上調表達。EMSA鑒定到SlNAC29能夠直接與衰老相關基因家族SAGs成員（）啟動子綁定，且在OE:中的相對表達量較野生型和突變體顯著增加?！窘Y論】轉錄因子SlNAC29調控番茄植株的衰老，促進番茄葉片在黑暗誘導條件下的衰老進程。SlNAC29直接綁定衰老相關基因啟動子區(qū)域調控其轉錄表達。

番茄；SlNAC29；轉錄調控；衰老；

0 引言

【研究意義】植物衰老是指植株在生長發(fā)育過程中由外部環(huán)境和內部遺傳因素共同控制導致生理功能衰退，最終自然死亡的過程[1]。葉片衰老是植物葉片生長發(fā)育的最后階段，是植物衰老的直接體現(xiàn)。提早衰老（即早衰）嚴重影響作物的光合作用、營養(yǎng)吸收和物質轉運等過程。番茄是連續(xù)發(fā)育多葉片多節(jié)間植物，早衰在其長季節(jié)栽培中尤為突出，極大地限制了番茄產(chǎn)量和品質潛力的發(fā)揮[2]。植物衰老是基因控制的程序化衰亡，轉錄因子是其中重要的調控因子。相對于模式植物擬南芥而言，人們對早衰問題較為嚴重的番茄作物的衰老關鍵轉錄因子及其調控過程還知之甚少。對其開展研究，對于延長番茄生育期，提高作物產(chǎn)量和品質，具有重要的理論和現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】植物NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）家族是調控植株衰老的重要轉錄因子[3]。擬南芥自然衰老進程中，30余個NAC基因表達量增強[4]。過表達擬南芥NAC轉錄因子、、、、等會引起植株早衰，敲除這些基因則可以延緩衰老[5-8]。與此相似，過表達水稻顯著加速了植株衰老進程，而敲除該基因可明顯延緩衰老[9]。在棉花中，通過RNAi方法降低NAC轉錄因子亞家族成員的表達量可延緩植株衰老，提高棉花產(chǎn)量和纖維質量[10]。番茄早衰相關的研究也有一定報道，與擬南芥AtNAC2同源的NAC轉錄因子SlORE1s（）的RNAi株系衰老延遲，碳同化增強，果實數(shù)量和可溶性固形物含量增加[11]。此外，在黑暗環(huán)境誘導衰老條件下，與同源的過表達番茄植株相較于野生型對照提早衰老。RNAi抑制則延緩其衰老進程，提高了果實產(chǎn)量和含糖量[12]。進一步探究發(fā)現(xiàn)，SlNAP2能夠直接轉錄調控衰老相關基因（）、葉綠素降解基因（）和（）、ABA合成基因（）、轉運基因（）以及降解基因（ABA 8-hydroxylase）。【本研究切入點】多種植物NAC轉錄因子家族成員在調控植株衰老中發(fā)揮了重要的作用。番茄作為連續(xù)花芽分化和坐果的重要園藝作物，早衰是決定其生長期長短、產(chǎn)量高低和品質優(yōu)劣的重要因素。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)SlNAP2參與調控衰老及葉綠素降解等相關基因如、的表達。為的同源基因，在氨基酸水平有約72.7%的相似度，但其在調控番茄衰老中的功能及機制尚不明確，研究番茄SlNAC29在衰老中的功能及其靶標基因，有利于增進對番茄衰老及其調控機制的認識?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬在明確在番茄不同衰老階段轉錄本變化及亞細胞定位的基礎上，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建突變體，利用基因過表達技術構建OE:穩(wěn)定過表達植株；在自然狀態(tài)及黑暗處理誘導衰老條件下，通過對植物葉綠素含量和光合作用相關參數(shù)的分析，明確SlNAC29在調控植株衰老中的生物學功能；利用基因轉錄分析和EMSA的方法，鑒定SlNAC29直接轉錄調控的靶標基因及其與衰老調控的關系，以期為園藝栽培中番茄的衰老調控及種質創(chuàng)新提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年在浙江大學農業(yè)與生物技術學院蔬菜研究所實驗溫室和實驗室進行。

1.1 試驗材料

供試番茄（）材料Condine Red（CR）為野生型對照（wild-type，WT）。番茄種子置于28℃培養(yǎng)箱，2—3 d后，播種至裝有草炭、蛭石混合基質（體積比為3﹕1）的72孔穴盤，待植物長出2片真葉，移苗至營養(yǎng)缽（外徑10 cm，高8.5 cm）中繼續(xù)生長?？刂粕L環(huán)境條件與番茄適宜的自然生長條件相一致[13]：光周期16 h/8 h（晝/夜），溫度25℃/21℃（晝/夜），濕度80%左右，光照強度為200 μmol·m-2·s-1，其間觀察植株長勢、葉綠素含量和光合作用等指標。黑暗是一種被廣泛用以誘導植株衰老的處理方式[14]。黑暗環(huán)境會引起葉片變黃，光合作用和葉綠素含量的下降，衰老相關基因的表達增強[15]。對于黑暗誘導葉片衰老試驗，待播種后5周左右，摘取植株第二、三片完全展開葉于濕潤濾紙上，覆以錫箔紙遮光誘導衰老，7 d后測定葉綠素含量及相關基因相對表達量。

1.2 SlNAC29突變體植株的構建

參照Pan等[16]方法構建的CRISPR/ Cas9載體。通過CRISPR-P 2.0網(wǎng)站設計靶序列（5′- TTCGATCCCTGGGTATTACC-3′）[17]，將合成的靶序列退火并插入AtUb-sgRNA-AtUBQ-Cas9載體的Ⅰ位點，然后連接至雙元表達載體pCAMBIA1301，轉化至根癌農桿菌GV3101中，通過組織培養(yǎng)技術獲得基因編輯材料[18]。采用DNA測序對CRISPR/Cas9誘導的突變進行測定，進一步篩選出2個純合無Cas9的T2代突變體株系-1和-2，所用引物見表1。

1.3 SlNAC29過表達植株的構建

根據(jù)番茄基因組數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）獲得（Solyc05g007770）的編碼序列（coding sequence，CDS），利用Primer5軟件設計過表達特異性引物（表1）。擴增并連接到載體pFGC1008-3×HA上，重組質粒構建成功后，電擊轉化至GV3101中，同樣采用植物組織培養(yǎng)的方法將重組載體轉化至番茄。組織培養(yǎng)獲得的OE:T0代植株取嫩葉葉片提取蛋白后進行Western blot驗證，具有目的條帶的T0代株系用于連續(xù)繁種篩選，并獲得2個純合的T2代株系OE:-1和OE:-2。

1.4 SlNAC29的亞細胞定位

將的CDS區(qū)構建到C端含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標簽的載體上，引物序列見表1。將構建好的載體轉化GV3101，在本氏煙草葉片（帶有紅色熒光蛋白RFP標簽的核定位蛋白煙草）中進行瞬時過表達，2 d后進行激光共聚焦觀察（Zeiss LSM 780）。GFP的激發(fā)光和發(fā)射光為488 nm/500—530 nm，RFP的激發(fā)光和發(fā)射光為561 nm/580—620 nm。

1.5 植物總RNA提取、反轉錄及qRT-PCR分析

參照TIANGEN RNA Simple Total RNA Kit的試劑盒說明書操作步驟提取植物總RNA。參照TOYOBO反轉錄試劑盒進行cDNA合成。qRT-PCR反應條件及體系參見SYBR Green TR-PCR Kit試劑盒（Takara，RR420A），在LightCycler?480Ⅱ Real-Time PCR detection system（Roche，Swiss）中進行。以作為內標，相對基因表達參照2-ΔΔCT法[19]計算。候選基因的特異性引物及引物見表1。

1.6 光合速率測定

選取5周齡左右植株的第二、三片完全展開葉，用LI-6400型光合熒光測量系統(tǒng)（美國LI-COR公司）測定番茄凈光合作用速率（n）。測定條件：光強為500 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μL·L-1，葉面溫度為（25±1.5）℃。

1.7 葉綠素含量測定

選取5周齡左右植株的第二、三片完全展開葉，采用英國Hansatech公司的手持式葉綠素含量測定儀CL-01 Chlorophyll Content Meter測量葉片葉綠素含量。

1.8 基因表達聚類熱圖分析

利用MeV（Multiexperiment viewer）聚類分析軟件對OE:材料中衰老相關的29個基因表達進行分析。包括：1）（）等衰老直接相關基因（SAGs）；2）（）等葉綠素降解相關基因；3）（）等ABA合成和信號轉導相關基因。

1.9 凝膠遷移阻滯分析（electrophoretic mobility shift analysis，EMSA）

參照Hellman等[20]方法構建原核表達載體pET32a-SlNAC29，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21中。加入終濃度為0.1 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG），6 h后收集菌體，超聲破碎后進行SDS-PAGE檢測。利用Novagen公司的pET蛋白純化體系進行蛋白純化。探針的標記使用Thermo Fisher Scientific公司的Biotin 3′End DNA Labeling Kit試劑盒，退火為DNA雙鏈。進一步利用LightShift? Chemiluminescent EMSA Kit試劑盒進行EMSA反應，最后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行曝光顯色。

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗設3個重復，每個重復6棵植株。試驗結果均為3次生物學重復的平均值。利用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù)，SAS 9.1 Tukey法進行差異顯著性分析，Origin 2019進行圖形繪制。

表1 引物

2 結果

2.1 不同衰老階段葉片SlNAC29表達的差異

（Solyc05g007770）為（Solyc04g005610）的同源基因，在氨基酸水平約有72.7%的相似度（圖1-A）。為了探究在植株衰老中的作用，參考Ma等[12]試驗方法把葉片分為嫩葉（young leaves，YL）、成熟葉（mature leaves，ML）、初老葉（early senescent leaves，ES）和衰老葉（senescent leaves，SL）（圖1-B），并采用qRT-PCR方法分析在不同衰老階段葉片中的基因表達差異。與成熟葉相比，嫩葉中表達量無明顯變化，而初老葉和衰老葉中的基因表達量均顯著上升，分別是成熟葉的35倍和1 757倍（圖1-B）。對SlNAC29進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)SlNAC29-GFP定位在細胞膜和細胞核（圖1-C）。

2.2 SlNAC29突變及過表達對自然生長狀態(tài)下植株衰老的影響

為了探究SlNAC29是否參與植株衰老的調控，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術和基因過表達技術分別獲得2個純合基因突變株系-1和-2以及2個純合基因過表達株系OE:-1和OE:-2。其中，-1的靶序列處缺失7個堿基，-2的靶序列處缺失11個堿基，均導致翻譯提前終止（圖2-A），過表達株系在C端攜帶的HA蛋白標簽能夠利用Western Blot的方法予以鑒定（圖2-B）。與WT相比，突變體植株的生長沒有明顯變化，而OE:植株葉片發(fā)黃、株型矮?。▓D2-C）。在第5周，對不同植株的第二、三片真葉進行葉綠素含量和氣體交換參數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)與WT均無顯著差異，OE:的葉綠素含量和光合速率（n）分別是WT植株的25%和50%（圖2-D和圖2-E）。以上結果表明，在自然生長狀態(tài)下，突變體和WT植株無明顯差異，而過表達則加劇了植株的衰老進程。

A：SlNAC29和SlNAP2蛋白序列比對。*：2種蛋白中相同的氨基酸；B：qRT-PCR檢測野生型植株不同衰老階段葉片中SlNAC29的表達量?！铮涸赑＜0.05水平上差異顯著（n=3）。YL：嫩葉，ML：成熟葉，ES：初老葉，SL：衰老葉；C：SlNAC29亞細胞定位。比例尺=50 μm

A：Slnac29突變體基因編輯位點示意圖；B：Western Blot驗證SlNAC29 2個純合過表達株系中SlNAC29-HA融合蛋白；C：SlNAC29突變體及過表達植株5周齡生長表型；D：SlNAC29突變體及過表達植株葉綠素含量；E：SlNAC29突變體及過表達植株光合速率。葉綠素含量及光合速率均測定5周左右植株第二、三片成熟葉。誤差線表示3次測量均值的標準差，不同小寫字母表示不同處理組間在P＜0.05水平顯著性差異。下同

2.3 SlNAC29突變和過表達對黑暗條件下葉片衰老的影響

選取WT、和OE:植株葉片，參考Ma等[12]方法進行離體連續(xù)黑暗處理誘導葉片衰老，置于正常光周期的離體葉片作為對照。7 d后，突變植株葉片衰老程度明顯較輕，OE:植株的葉片衰老較WT更為嚴重（圖3-A）。植株葉片的葉綠素含量明顯高于WT植株，而OE:植株則相反（圖3-B）。進一步對葉片的基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)黑暗誘導衰老后葉片中衰老相關基因、以及葉綠素降解相關基因、表達量均明顯低于WT植株，而OE:葉片中上述基因表達量均明顯上升（圖3-C）。此外，正常光周期對照條件下，中葉綠素含量和衰老相關基因轉錄本與WT沒有顯著性差異，而過表達植株較WT植株同樣具有較低的葉綠素含量和較高的衰老相關基因轉錄本（圖3-C）。以上數(shù)據(jù)表明，在黑暗誘導衰老的條件下，降低了衰老和葉綠素降解相關基因的表達量，減輕了葉片衰老程度，而OE:則提高了衰老和葉綠素降解相關基因的表達，加重了葉片衰老程度。

2.4 SlNAC29綁定及轉錄激活的靶標基因鑒定

為了進一步闡明SlNAC29在分子水平上調控衰老的機制，利用OE:材料對衰老相關的29個基因的相對表達量進行分析。如圖4-A所示，大部分基因尤其是SAGs和葉綠素降解基因在OE:植株中顯著上調表達。進一步選取黑暗誘導衰老條件下、OE:及WT植株中明顯差異表達的、、和4個基因進行凝膠遷移阻滯分析。通常NAC轉錄因子的目標啟動子核心結合位點為CACG[21]，序列分析表明、、和的啟動子均具有多個NAC核心結合位點（表2）。結果發(fā)現(xiàn)，特異性地與啟動子綁定，但未與、和發(fā)生綁定結合（圖4-B）。此外，在植株水平，株系中的表達量較WT植株無差異，但在OE:株系中其表達量顯著增加（圖4-C）。在分子水平上，SlNAC29直接綁定衰老相關基因啟動子區(qū)域，并正調控其表達，表明SlAGT1可能在SlNAC29調控的植株衰老過程中發(fā)揮一定的作用。

A、B：黑暗誘導葉片衰老表型圖及葉綠素含量；C：對照與黑暗誘導衰老條件下，葉片中衰老相關基因的相對表達

表2 目標基因啟動子的SlNAC29靶標位點統(tǒng)計

3 討論

番茄是中國栽培面積最大的重要蔬菜作物之一。近年來，隨著長季節(jié)栽培等技術的規(guī)?；瘧?，植株早衰導致的產(chǎn)量不高和品質不良逐漸成為影響番茄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要瓶頸[22]。因此，研究調控番茄衰老的關鍵基因及其調控機制對于延緩番茄衰老進程，充分發(fā)揮其生物潛能具有重要意義。

植株衰老由一系列的內部和外部信號觸發(fā)，包括植株苗齡、植物激素、弱光/黑暗等環(huán)境壓力和病原體感染等[23-24]。在這套錯綜復雜的調控網(wǎng)絡機制中，轉錄因子是其中重要的調控因子[25]。NAC轉錄因子目前被廣泛報道在植物植株衰老調控中發(fā)揮重要作用，但是作用機制尚不清楚[26-27]。已有研究發(fā)現(xiàn)番茄SlNAP2參與調控植株衰老，作為的同源基因，其在衰老中的作用及機制尚不清晰。本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的NAC轉錄因子SlNAC29調控植株衰老及其機制。黑暗誘導條件下，過表達呈現(xiàn)早衰，然而突變體能夠顯著減輕植株衰老程度，維持碳同化的正常進行。本研究發(fā)現(xiàn)單突變體即可發(fā)揮作用，后續(xù)可以繼續(xù)構建和的雙突變體材料，以探究二者共同的作用機制。此外，同源基因擬南芥已被鑒定為植株衰老的中樞正向調節(jié)因子。近期有研究發(fā)現(xiàn)即可被多種脅迫強烈誘導，過表達對2種細菌性病害以及干旱的防御能力顯著增強[28]。本研究發(fā)現(xiàn)突變體植株衰老程度顯著減輕，是一種能夠抑制番茄早衰的優(yōu)良種質資源。

通常情況下，轉錄因子都是通過直接識別下游靶基因的啟動子區(qū)域，轉錄激活或抑制靶基因表達，從而影響植株的生長發(fā)育[29]。探究轉錄因子下游的靶基因對明確轉錄因子的作用機制至關重要。據(jù)報道，擬南芥基因組中約有10%的基因或超過2 500個基因在植株衰老過程中上調[30-31]。許多衰老相關基因參與諸如基因調控、信號轉導、大分子物質降解和營養(yǎng)物質再轉化等衰老過程[32]。本研究中，黑暗誘導衰老條件下，OE:的（如）和葉綠素降解基因（如）顯著上調表達，在植株中則相反。選取黑暗誘導衰老條件下突變體OE:及WT植株中明顯差異表達的、、和4個基因進行凝膠遷移阻滯檢測。其中，特異性地與啟動子綁定，但未與、和發(fā)生綁定結合。在植株體內，株系中的表達較WT植株無差異，但OE:株系中其表達量顯著增加。前人研究表明番茄SlNAP2能夠激活衰老相關基因，葉綠素降解基因和等，從而直接調控葉片衰老。擬南芥中AtNAP能夠直接綁定加速促進植株衰老[33]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)OE:中衰老相關基因表達量與野生型相比無顯著變化，而表達量則相對較高（圖5-A），且其啟動子區(qū)域能夠被SlNAC29直接綁定。因此，推測SlNAC29與NAC家族其他轉錄因子的作用機制有所不同，是一條NAC轉錄因子調控植株衰老的新路徑。作為衰老相關基因SAGs的成員，在植株衰老進程中能夠顯著上調表達，然而，關于其調控植株衰老的具體機理尚待進一步深入研究。

4 結論

在番茄作物中發(fā)現(xiàn)了一個重要的NAC家族轉錄因子SlNAC29，其在衰老葉片中顯著上調表達。黑暗誘導衰老條件下，突變體能夠延緩葉片衰老，而過表達OE:葉片衰老程度加劇，表明SlNAC29能夠調控番茄植株的衰老，促進番茄葉片在黑暗誘導條件下的衰老進程。進一步發(fā)現(xiàn)SlNAC29直接綁定衰老相關基因啟動子區(qū)域調控其轉錄表達。

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The Role and Mechanism of Tomato SlNAC29 Transcription Factor in Regulating Plant Senescence

WANG Ping, ZHENG ChenFei, WANG Jiao, HU ZhangJian, SHAO ShuJun, SHI Kai

College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058

【Background】Tomato（）is an important horticultural crop with continuous flower bud differentiation and fruiting. Premature senescence seriously limits tomato plants growth period, crop yield and fruit quality. NAC (NAM, ATAF1/2 and CUC2) transcription factor family regulates leaf senescence process in Arabidopsis, rice and other plants. Nevertheless, the roles of tomato NAC transcription factor in the regulation of leaf senescence have not been well understood. SlNAP2 (NAC-like, activated by apetala3/pistillata) is known to be involved in the regulation of tomato leaf senescence. 【Objective】SlNAC29 transcription factor is the homologous gene of SlNAP2 in tomato, while its function remains largely unclear. In this study, the role of SlNAC29 and its underlying mechanism in leaf senescence was investigated, which can provide some scientific basis for tomato senescence regulation and germplasm innovation.【Method】Condine Red (CR) was used as the wild-type background in this study. qRT-PCR was used to analyze the relative expression ofhomozygous mutant lines and the OE:stable overexpression lines were generated through CRISPR/Cas9 gene editing and over-expression approaches, respectively. Using these lines, plant growth phenotypes, chlorophyll content, leaf photosynthesis, transcription of senescence- and chlorophyll degradation- related genes were analyzed under both natural and dark-induced senescence conditions. The clustering heat map was used to analyze the relative expression of 29 genes, including senescence-, chlorophyll degradation- and ABA biosynthesis/signaling-associated genes. Based on gene expression profiles, four of them were selected to electrophoretic mobility shift analysis (EMSA) to identify the SlNAC29-target gene during senescence process.【Result】The relative expression ofwas significantly up-regulated in early senescent and senescent leaves, as compared with young and mature leaves. Under natural growth condition, themutant lines showed no differences with the wild-type in terms of plant growth phenotypes and photosynthetic rate. By contrast, the height of OE:plant was shorter than wild-type plants, OE:plants also showed lower chlorophyll content and photosynthetic rate, which were only 25% and 50% of the wild-type control, respectively. Under dark-induced senescence condition, the leaves of wild-type plants turned yellow and the chlorophyll content decreased significantly. The senescent phenotypes were alleviated inmutant lines, which not only have significant higher chlorophyll content, but also showed higher transcript level of senescence-associated genes (SAGs) and chlorophyll degradation-related genes. On the contrary, the dark-induced senescence effect was aggravated in OE:. Cluster analysis showed that several genes, especially SAGs and chlorophyll degradation-related genes,,and, were significantly up-regulated in OE:plants. The EMSA analysis showed that SlNAC29 could directly bind to the promoter of(), a member of. Moreover, the relative expression ofwas significantly higher than that of wild-type andplants. 【Conclusion】SlNAC29 transcription factor is involved in the regulation of leaf senescence in tomato plants, which promotes the senescence process under dark conditions. SlNAC29 may directly bind to the promoter region of the senescence-related geneto regulate its transcriptional expression.

tomato; SlNAC29; transcription regulation; senescence;

2021-02-06；

2021-05-03

國家自然科學基金優(yōu)青項目（31822046）、浙江省重點研究發(fā)展計劃（2021C02040）、國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2019YFD1000300）

王萍，E-mail：11916061@zju.edu.cn。通信作者師愷，E-mail：kaishi@zju.edu.cn

（責任編輯 李莉）