趙嬋娟，何先林，, 鄢行安，肖國生，曹立亭, 韓 凱

(1. 重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技學(xué)院，重慶 萬州 404155 ； 2. 西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 400700 ；3. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬州 404155 ； 4. 湖北遠(yuǎn)昊生物科技有限公司，湖北 鐘祥 431900)

腹瀉是造成全球死亡數(shù)量最高的十大疾患之一，以腹瀉為主癥的急慢性腸炎、腸易激綜合征、胃腸功能紊亂等多種消化道疾病皆屬于中醫(yī)學(xué)的“泄瀉”范疇[1]，并認(rèn)為脾虛及濕盛是其基本病機(jī)?！秲?nèi)經(jīng)》有云：“脾病者，……虛則腹脹腸鳴，飧泄食不化”。一些研究表明，脾虛泄瀉主要引起胃腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的損傷[2]，并發(fā)現(xiàn)益氣健脾藥，如四君子湯、補(bǔ)中益氣湯、參苓白術(shù)散能促進(jìn)胃腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷的修復(fù)，以及能提高脾虛泄瀉證大鼠Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)[3]。本試驗(yàn)為研究“苓術(shù)止瀉口服液”對脾氣虛泄瀉大鼠腸組織結(jié)構(gòu)屏障的影響，以期為進(jìn)一步闡明“苓術(shù)止瀉口服液”胃腸道藥理作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只健康SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，雌雄各半，9周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)公司，動物合格證書SCXK(湘)2019—0004。購回的動物飼養(yǎng)于重慶三峽職業(yè)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)動物中心，環(huán)境溫度(22±2)℃，通風(fēng)良好，室內(nèi)明暗各保持12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，試驗(yàn)前12 h保持禁食不禁水。

1.2 試驗(yàn)藥物 番瀉葉、茯苓、白術(shù)等生藥飲片，購自重慶萬州東方大藥房，經(jīng)重慶三峽職業(yè)學(xué)院具有中藥鑒定師資格的教師鑒定合格。苓術(shù)止瀉口服液由重慶三峽職業(yè)學(xué)院藥學(xué)專業(yè)教研室制備，濃度為1 g/mL。

造模藥液：按厚樸90 g、枳實(shí)90 g、大黃60 g稱取藥材，純凈水浸泡30 min，厚樸和枳實(shí)先煎煮10 min，大黃后下，再煎煮10 min，過濾除渣，重復(fù)煎煮2次，60 ℃常規(guī)濃縮為1 g/mL藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

陽性對照藥物參苓白術(shù)散水煎劑：人參100 g、麩炒白術(shù)100 g、炒白扁豆75 g、山藥100 g、茯苓100 g、蓮子50 g、桔梗50 g、砂仁50 g、炒薏苡仁50 g、甘草100 g稱取各中藥飲片，浸泡25 min后常規(guī)煎煮，連續(xù)2次，過濾去渣，60 ℃常規(guī)濃縮為1 g/mL藥液，4 ℃ 保存?zhèn)溆肹4]。

1.3 主要試劑與儀器 H.E.染色試劑盒(Solarloio，20190815)；TriQuick Reagent總RNA提取試劑(Solarbio，20190913)；2×EsTaqMaster Mix(康為世紀(jì)公司，50428)；HiFiScript gDNA Removal RT Master Mix(康為世紀(jì)公司，30412)；Eva Green 20×in water(Biotium，17E0.1-1075001)；大鼠二胺氧化酶(DAO) ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，19082069R)；大鼠D-乳酸(D-Lactate，D-LA)ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，19082039R)。TProfessional PCR儀(Biometra)；MJ MiniTMPersonal Thermal Cycler(美國BID-RAD)；切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司])；凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔儀器公司)；超低溫冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)等。

1.4 分組及造模 60只健康SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白對照組、脾虛泄瀉證病理模型組(簡稱：模型組)、苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組[40、20 g/(kg·bw)和10 g/(kg·bw)]與陽性藥物對照組。參照文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行大鼠的脾虛泄瀉證模型復(fù)制，即均采用“破氣+苦下+饑飽失?！狈?，按照4 mL/(200 g·bw)灌服造模藥液，2次/d，持續(xù)42 d。

1.5 干預(yù)方法 造模完成后次日進(jìn)行干預(yù)治療?？瞻讓φ战M與模型組：按照4 mL/(200 g·bw)灌服生理鹽水。苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組：按照4 mL/(200 g·bw)對應(yīng)灌服不同濃度的苓術(shù)止瀉口服液。陽性藥物對照組：按照4 mL/(200 g·bw)灌服陽性對照藥液水煎劑。1次/d，持續(xù)14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 無菌分離結(jié)腸，置于4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片4 μm。H.E.染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6.2 大鼠血清DAO和D-LA含量測定 各組大鼠末次給藥后禁食禁水24 h，麻醉后腹主動脈采血。血樣于4 ℃冰箱靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清中DAO和D-LA的水平。

1.6.3 大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)量的檢測 使用TriQuick Reagent試劑提取法抽提結(jié)腸組織中的總RNA，HiFiScriPt gDNA Removal RT Master Mix試劑盒進(jìn)行RNA的純化與反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取1 μL gDNA Remover Mix，一定量RNA Template 和適量RNase-free Water建立10 μL cDNA第1鏈的合成體系。再取cDNA第1鏈的合成體系10 μL，5×HiFiScriPt RT Master 4 μL，RNase-Free Water 6 μL，建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。cDNA合成反應(yīng)條件：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心后放置于冰上，再進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)或放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 進(jìn)行熒光定量PCR，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，建立20 μL 熒光定量PCR反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。定量采用2-△△Ct法計(jì)算。目的基因和引物見表1，PCR反應(yīng)體系見表2。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primers for real-time PCR

表2 Real-time PCR 反應(yīng)體系Table 2 Reaction system for real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 中藥苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)的影響 大鼠結(jié)腸切片顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，黏膜層單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊，刷狀緣清晰可見，有大量杯狀細(xì)胞，未見或少見炎性細(xì)胞浸潤(圖1A)；模型組大鼠黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性被破壞，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)腸黏膜層可見炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞減少(圖1B)；苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組，以及陽性藥物對照組大鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)上皮再生，其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性得到恢復(fù)，細(xì)胞排列連續(xù)性好、規(guī)則有序，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(圖1C～1F)。結(jié)果表明，苓術(shù)止瀉口服液能有效修復(fù)脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)。

圖1 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉證大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)的影響(H.E.染色，100×)Fig.1 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the morphology of colonic mucosa in rats with splenasthenic diarrhea (H.E. staining,100×)A:空白對照組; B:模型組; C:陽性藥物對照組; D:苓術(shù)止瀉口服液高劑量組; E:苓術(shù)止瀉口服液中劑量組; F:苓術(shù)止瀉口服液低劑量組A:Blank control group; B:Model group; C:Positive drug control group; D:Lingzhu Zhixie oral liquid high-dose group; E:Lingzhu Zhixie oral liquid medium-dose group; F:Lingzhu zhixie oral liquid low-dose group

2.2 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠血清中DAO和D-LA含量的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠血清中DOA和D-LA含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組和陽性藥物對照組大鼠血清中DOA和D-LA含量明顯降低(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術(shù)止瀉口服液高、中劑量組的大鼠血清中DOA和D-LA含量差異不顯著(P>0.05)，苓術(shù)止瀉口服液低劑量組差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠血清中DAO和D-LA含量的影響Fig.2 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the levels of DAO and D-LA in sera of rats with splenasthenic diarrhea圖中所標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05);下圖同Different letters in the figure indicate significant difference (P<0.05),and the same letter indicates no significant difference (P<0.05). The same as below

2.3 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸Occludin蛋白基因的mRNA相對表達(dá)量的影響 與空白對照組比較，模型組結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白Occludin的 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組和陽性藥物對照組的大鼠結(jié)腸Occludin蛋白基因的mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組的大鼠結(jié)腸Occludin 蛋白基因的mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，見圖3。

圖3 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸Occludin蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of Occludin protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

2.4 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉證大鼠結(jié)腸Claudin-1蛋白基因的mRNA相對表達(dá)量的影響 與空白對照組比較，模型組結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白Claudin-1的mRNA相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，苓術(shù)止瀉口服液組高、中、低劑量組和陽性藥物對照組大鼠結(jié)腸Claudin-1蛋白基因的mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術(shù)止瀉口服液中劑量組大鼠結(jié)腸Claudin-1蛋白基因的mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而高、低劑量組則差異不顯著(P>0.05)，見圖4。

圖4 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸Claudin-1蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of Claudin-1 protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

2.5 苓術(shù)止瀉口服液對脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸ZO-1蛋白基因的mRNA相對表達(dá)量的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，苓術(shù)止瀉口服液高、中、低劑量組和陽性藥物對照組大鼠結(jié)腸ZO-1蛋白基因的 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與陽性藥物對照組比較，苓術(shù)止瀉口服液中劑量組大鼠結(jié)腸ZO-1蛋白基因的mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而高、低劑量組差異不顯著(P>0.05)，見圖5。

圖5 “苓術(shù)止瀉口服液”對脾虛泄瀉大鼠結(jié)腸ZO-1蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of Lingzhu Zhixie oral liquid on the mRNA relative expression of ZO-1 protein in rat colons with splenasthenic diarrhea

3 討論

腸道上皮組織結(jié)構(gòu)所形成的機(jī)械(物理)屏障是腸黏膜屏障的首道防線，對維持機(jī)體健康有著重要作用。如腸上皮組織結(jié)構(gòu)的損傷則是引起腸道疾病的前提與基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，急慢性腸炎、腸易激綜合征等諸多臨床疾病均存在不同程度的腸黏膜屏障損傷[6]。研究顯示，一些中藥方劑，如參苓白術(shù)散作為中醫(yī)臨床上針對脾虛泄瀉、慢性腹瀉、功能性腹瀉等諸多臨床疾病的常用方，它具有保護(hù)腸黏膜、提高機(jī)體免疫力，以及調(diào)節(jié)腸道分泌功能與吸收功能平衡等諸多作用[7]，其分子機(jī)理則可能是參苓白術(shù)散能提高脾虛泄瀉大鼠腸黏膜免疫中的3個(gè)關(guān)鍵作用蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1表達(dá)，從而達(dá)到修復(fù)腸黏膜屏障損傷[8]。本試驗(yàn)選用參苓白術(shù)散作為陽性對照藥物，以評價(jià)苓術(shù)止瀉口服液的治療效果和作用機(jī)制。

研究證明，當(dāng)發(fā)生腸黏膜屏障被破壞、腸黏膜損傷時(shí)，腸黏膜細(xì)胞標(biāo)志酶DAO和D-LA 在血液中的含量水平會升高，可間接反映出腸黏膜通透性變化及腸機(jī)械屏障損害程度[9-10]。因此，DAO和D-LA為評估腸黏膜通透性與完整性的重要指標(biāo)[11-12]。同時(shí)，閉合蛋白Occludin、閉鎖蛋白Claudin-1以及連接復(fù)合物蛋白ZO-1是腸黏膜免疫中的3個(gè)關(guān)鍵蛋白。Occludin蛋白作為緊密連接的主要骨架蛋白，通過對緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定來完成對腸黏膜通透性的調(diào)節(jié)作用[13]；作為橋梁蛋白的連接復(fù)合物蛋白ZO-1則是通過連接Occludin蛋白的末端與細(xì)胞骨架蛋白相連，以達(dá)到穩(wěn)定緊密連接結(jié)構(gòu)的作用[14]；閉鎖蛋白Claudin-1通過Notch信號調(diào)節(jié)腸上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài),其表達(dá)量可反映上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與間皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞和功能受損程度[15-16]?？梢?，Occludin、Claudin-1和 ZO-1蛋白及其基因表達(dá)常被用于腸機(jī)械屏障功能的關(guān)鍵性檢測標(biāo)識[17]。

已有一些研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方、中藥提取物或中藥單體皆能通過調(diào)控3個(gè)蛋白基因的表達(dá)來修復(fù)受損的腸道黏膜屏障，如郁金散、腸炎清口服液，菊非藥用部位多糖以及單體大黃素[18-19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苓術(shù)止瀉口服液治療后脾虛泄瀉大鼠血清中DAO、D-LA含量明顯降低，且上調(diào)了結(jié)腸中Claudin-1、Occludin和ZO-1緊密連接蛋白的基因表達(dá)，表明苓術(shù)止瀉口服液的療效與大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，通過修復(fù)腸黏膜屏障的損傷，降低腸黏膜通透性，從而發(fā)揮其治療作用。