趙雪洋，王利豪，張婉婷，黃妮妮，王智豪，劉 帥，周變?nèi)A

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000)

隨著人們生活方式的改變，越來(lái)越多的家庭開(kāi)始飼養(yǎng)寵物犬，主人和犬的親密接觸，加劇了耐藥菌在動(dòng)物和人類(lèi)之間的傳播。大腸桿菌在人和動(dòng)物的腸道中普遍存在，屬于條件性致病菌[1-2]。大腸桿菌經(jīng)口感染人或動(dòng)物數(shù)小時(shí)后就可以進(jìn)入消化道后段，在體內(nèi)大量定居、繁殖，通過(guò)糞便傳播到環(huán)境中[3]，造成細(xì)菌在環(huán)境中的傳播[4]。動(dòng)物大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率都非常高[5]，防治主要依賴(lài)于抗菌藥物的使用[6]，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素以其殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)癥廣及療效好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床。伴隨抗生素大量使用，細(xì)菌的耐藥情況也逐漸凸顯[6-8]，寵物與人的密切接觸加劇了耐藥菌轉(zhuǎn)移給人的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生極大的危害[9-10]。本試驗(yàn)開(kāi)展了犬源大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物敏感性的分析及耐藥基因的檢測(cè)，為獸醫(yī)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 2018—2019年間從洛陽(yáng)市寵物醫(yī)院采集寵物犬直腸肛門(mén)拭子樣本，采集的樣本接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選單個(gè)菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，再挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上單菌落進(jìn)行生化鑒定和16S rDNA測(cè)序分析獲得大腸桿菌樣品40株。質(zhì)控菌株ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，藥敏紙片(表1)，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；酵母提取物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)，均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；DNA Marker、瓊脂糖、2×TaqMaster Mix，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

表1 藥敏紙片Table 1 Drug sensitive paper

1.3 藥敏試驗(yàn) 以ATCC 25922為質(zhì)控菌株，依照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2014版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer，K-B)對(duì)9種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

1.4.1 細(xì)菌基因組DNA的制備 取分離菌純培養(yǎng)物1 mL于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，50 μL超純水重懸沉淀，混勻，沸水中煮沸10 min，冷卻后，12 000 r/min離心5 min，上清即為細(xì)菌基因組DNA模板。

1.4.2 PCR反應(yīng) 參照 GenBank 中耐藥基因的序列，設(shè)計(jì)7 對(duì)引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 8 μL，總體系為20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、退火溫度15 s、72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

表2 PCR擴(kuò)增引物和條件Table 2 Primers and conditions for PCR amplification

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 對(duì)40株分離的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，大腸桿菌對(duì)青霉素類(lèi)藥物氨芐西林、羧芐西林和阿莫西林的耐藥率均大于85.0%，其中對(duì)氨芐西林的耐藥率達(dá)到100%；對(duì)頭孢菌素類(lèi)藥物的耐藥率相對(duì)較低，對(duì)頭孢噻肟和頭孢吡肟的耐藥率為32.5%，對(duì)頭孢克肟和頭孢曲松的耐藥率為37.5%，對(duì)頭孢他啶和頭孢西丁的耐藥率為15.0%。

表3 大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的敏感性分析Table 3 β-lactams drug sensitivity analysis in Escherichia coli

2.2 多重耐藥性分析 如圖1所示，在分離菌株中，全部對(duì)至少1種藥物耐藥，95%的菌株表現(xiàn)出對(duì)3種或3種以上抗菌藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥性。有15株菌為3耐，9株菌為4耐，4株菌為5耐，3株菌為6耐，5株菌為7耐，2株菌為9耐。

圖1 大腸桿菌的多重耐藥性分析Fig.1 Analysis of multiple drug resistance in Escherichia coli

2.3 耐藥基因的檢測(cè)分析 采用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行了β-內(nèi)酰胺類(lèi)7種耐藥基因的檢測(cè)。其中有14株含有blaDHA，有10株含有blaSHV，有22株含有blaOXA，有22株含有blaCTX-M，40株均含有blaCMY、blaPSE和blaTEM(圖2A)。大腸桿菌分離株同時(shí)含有不同種類(lèi)耐藥基因的現(xiàn)象嚴(yán)重，有10株含有3種耐藥基因，有6株含有4種耐藥基因，有12株含有5種耐藥基因，有8株含有6種耐藥基因，有4株含有7種耐藥基因(圖2B)。

圖2 耐藥基因的檢測(cè)分析Fig.2 Analysis of drug resistance genesA：β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因型分布情況； B：大腸桿菌含3種以上耐藥基因檢出情況A：Distribution of β-lactam drugs resistant genotypes； B：Detection of more than three resistance genes in Escherichia coli

3 討論

大腸桿菌血清型復(fù)雜，難以免疫防治，藥物防治仍是控制的主要手段，主要包括青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)廣譜半合成抗生素，以其廣譜、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床。本試驗(yàn)中，大腸桿菌菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥性高，尤其是對(duì)青霉素類(lèi)藥物的耐藥性較高，其中氨芐西林、羧芐西林和阿莫西林的耐藥率分別為100%、85%和 90%，這可能是因?yàn)榍嗝顾仡?lèi)藥物作為臨床上較為早期使用的抗菌藥物，隨著藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用促進(jìn)了耐藥菌株的產(chǎn)生，加之藥物的不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株擴(kuò)散蔓延，這與之前的報(bào)道相一致[11]。

大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制為質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，進(jìn)而水解藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性[12]。根據(jù)Bush-Jacoby-Medeiros分類(lèi)方法，可以將β-內(nèi)酰胺酶可以分為A、B、C和D四類(lèi)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，犬源大腸桿菌分離株同時(shí)對(duì)3種以上β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥的菌株高達(dá)95%，出現(xiàn)多藥耐藥。進(jìn)一步對(duì)7種β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，洛陽(yáng)市寵物犬源大腸桿菌介導(dǎo)耐藥基因主要以blaCMY,blaPSE和blaTEM為主。

綜上，洛陽(yáng)市寵物犬源大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥性較高，且具有明顯的多藥耐藥現(xiàn)象。因此，嚴(yán)格執(zhí)行《獸藥管理?xiàng)l例》等法律法規(guī)，合理使用抗菌藥物，對(duì)有效控制和減少耐藥性的產(chǎn)生，降低耐藥菌株傳遞給人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)，維護(hù)公共衛(wèi)生的安全具有重要意義。