李 樺，黎增權，屈 倩，劉 翠，郭世寧，石達友

(1. 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 510260 ; 2. 華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642)

熱應激的機制被認為是由中樞神經系統(tǒng)而不是周圍器官的紊亂引起的，對腸道功能的理解也集中在營養(yǎng)物質的消化和吸收上[1-2]。補益類中藥所含多糖成分對于腸道益生微生物有扶植作用，其所產的代謝物又對致病微生物的生長有間接抑制作用[3-5]?？诜兴幈粰C體腸道菌群代謝后，產生的代謝產物具有高效藥理作用[6-8]。多糖、皂苷、黃酮類等物質是中藥藥效的基礎成分，在宿主腸道菌群或與宿主共代謝的條件下，可促進乳酸桿菌、雙歧桿菌的繁殖，導致大腸桿菌等腸道致病菌繁殖受阻[9]。本試驗旨在探討大鼠熱應激與腸道菌群變化的關系，并為中藥復方和益生素干預熱應激的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 試驗在華南農業(yè)大學實驗動物中心開展[許可證號：SYXK(粵)2019—0136]。7周齡SPF級雄性Wistar大鼠，(180±10) g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，質量合格證號：440021000005777。

1.2 試驗藥品與制備 中藥復方由紫錐菊、黃芩、藿香、香薷、石膏、陳皮、白術、甘草8味中藥組成，其中香薷、藿香和陳皮加8倍量水泡0.5 h，提取揮發(fā)油5 h，收集揮發(fā)油備用，蒸餾后的水溶液另器收集。藥渣與其余5味藥材加10倍量水煎煮3次，每次2 h，合并煎液，濾過，減壓濃縮至含量為1.12 g/mL生藥，濾過，即得。益生素：上海申亞動物保健有限公司，批號：5405201506HF。大鼠血清HSP70試劑盒，南京建成生物技術有限公司，批號：DZE30341。

1.3 試驗設計 20只成年Wistar雄性大鼠，隨機分成4個組，每組5只，常溫空白組(Normal temperature control group, NC group)、中藥組(Traditional Chinese medicine group, TCM group)、益生素組(Probiotic group, Pro group)和熱應激組(Heat stress group, HS group)。常溫空白組于溫度20～26 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)；其余3個組用室內加熱器將環(huán)境溫度保持在35～38 ℃，濕度在50%～60%。中藥組在熱應激下，每天按7 mg/(kg·bw)灌服中藥，灌服濃度和體積按實驗動物質量計算[10]，益生素組灌服與中藥組等體積0.04%益生素，熱應激組和常溫空白組分別于熱應激下和常溫下灌胃等量生理鹽水，自由飲水、采食，試驗期7 d。分別在熱應激3 h、1 d、3 d和7 d后，麻醉后腹主動脈采血，用于檢測血清HSP70蛋白，采用抗大鼠 HSP70 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 HSP70與單抗結合的雙抗體夾心 ABC-ELISA法。收集盲腸內容物約5 g，提取總DNA，進行16S rDNA v3～v4段測序和盲腸腸道微生物群分析。

1.4 生物信息學與統(tǒng)計分析 剔除小于200 bp且不明確的堿基標記，合并相同或重復的序列，檢查并移除嵌合體序列。α多樣性包括Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和稀釋曲線。通過單樣本分析(α多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計分析指標來估計環(huán)境群落物種的豐度和多樣性。β多樣性分析包括主成分分析(PCA)和主坐標分析(PCOA)，樣本間的差異和距離可以通過PCA用方差分解來反映，如樣品的組成比較相似，反映出PCA圖中距離越近。通過PCOA分析得到不同樣本的距離矩陣信息。群落功能預測與分析是將每個試驗組的腸道微生物基因集與基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)進行比較，通過構建測序基因組的功能基因獲得16S rDNA測序中的物種組成信息。

2 結果

2.1 大鼠不同時期血清HSP70濃度的變化 由表1可知，熱應激各時期，熱應激組血清HSP70濃度均極顯著升高(P<0.01)；熱應激3 h到熱應激3 d，中藥組和益生素組大鼠血清HSP70濃度差異不顯著(P>0.05)。

表1 大鼠不同時期血清HSP70濃度Table 1 Serum HSP70 concentration in rats at different stages (ng/L,n =5)

2.2 熱應激對大鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)的影響熱應激3 h、1 d、3 d和7 d各試驗組之間的多樣性指數(shù)分別如表2～5所示。由表2可知，熱應激3 h時，中藥組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)與熱應激組相比顯著升高(P<0.05)，中藥組PD_whole_tree極顯著高于熱應激組(P<0.01)，常溫空白組Shannon指數(shù)顯著高于熱應激組(P<0.05)；由表3可知，熱應激試驗1 d時，各組多樣性指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；由表4可知，熱應激3 d時，熱應激組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著低于中藥組(P<0.05)和常溫空白組(P<0.05)，各組PD_whole_tree指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，中藥組Shannon指數(shù)與益生素組相比顯著升高(P<0.05)；由表5可知，熱應激7 d時，益生素組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)分別與熱應激組相比顯著和極顯著升高(P<0.05和P<0.01)，而熱應激組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)分別與常溫空白組相比也顯著和極顯著降低(P<0.05和P<0.01)，各試驗組Shannon指數(shù)無顯著差異(P>0.05)?？梢?，大鼠盲腸腸道微生物的多樣性因處熱應激環(huán)境而降低，通過中藥復方口服液和益生素，可使熱應激下腸道菌群物種多樣性處于高于正常水平，從而抵御熱應激對腸道的損傷。

表2 熱應激3 h各試驗組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 2 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 3 hours of heat stress

表3 熱應激1 d各試驗組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 3 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 1 day of heat stress

表4 熱應激3 d各試驗組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 4 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 3 days of heat stress

表5 熱應激7 d各試驗組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 5 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 7 days of heat stress

2.3 熱應激對大鼠腸道微生物群β多樣性指數(shù)的影響 本試驗采用了主成分分析(PCA)和基于UniFrac距離上對各試驗組之間進行加權(Weighted)和非加權(Unweighted)的主坐標分析(PCoA)。見圖1，代表2個樣本的點的距離越近其樣本組成越相似。在熱應激3 h階段，各試驗組組內數(shù)據(jù)比較集中，各組內個體差異較小，中藥組、益生素組和熱應激組的腸道菌群開始出現(xiàn)差異性，說明在經歷熱應激3 h時各組大鼠盲腸腸道菌群開始出現(xiàn)變化，與常溫大鼠的腸道菌群多樣性相比，這種變化由中藥復方、益生素引起；到了熱應激7 d，各試驗組組內散點基本聚在一起，說明各組內個體差異較小，常溫空白組與其余3個組的散點、熱應激組與其余3個組散點，還有常溫空白組與熱應激組散點完全分開，而中藥組與益生素組的散點基本交疊，表明大鼠經歷了7 d熱應激后，未經治療的熱應激大鼠腸道菌群多樣性與常溫大鼠相比已有明顯差異，這是由熱應激帶來的損傷引起的；7 d熱應激過程中，一直用中藥復方和益生素治療確實對大鼠盲腸腸道菌群多樣性差異帶來顯著影響，而中藥和益生素產生的積極影響相似。

圖1 各試驗組大鼠腸道菌群多樣性差異的PCA分析Fig.1 PCA analysis of differences in intestinal flora diversity among each experimental groupA:熱應激3 h后; B: 熱應激7 d后； 黑色：中藥組； 紅色：益生素組； 綠色：熱應激組； 藍色：常溫空白組A:3 h after heat stress； B:7 d after heat stress; Black:Traditional Chinese medicine group; Red:Probiotic group; Green:Heat stress group; Blue:Normal temperature control group

如圖2所示，在熱應激3 h，基于UniFrac分析的非加權和加權差異分析，第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為13.99%、8.71%和52.76%、12.92%，各試驗組組內出現(xiàn)比較明顯的分離，但試驗組間趨向于不同象限，說明大鼠盲腸腸道微生物的多樣性差異因熱應激環(huán)境以及口服中藥與益生素發(fā)生變化。如圖3所示，在熱應激7 d，第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為29.21%、18.84%和9.67%、8.68%，各試驗組散點完全分離，組間象限分布趨勢較試驗3 h時明顯，其中熱應激組和常溫空白組分離的距離最遠，中藥組和益生素組介于中間，但分離距離與常溫空白組靠近。說明隨著熱應激的進行，各試驗組腸道菌群多樣性的差異較在熱應激3 h明顯，隨著熱應激下口服中藥復方和口服益生素，熱應激大鼠腸道微生物多樣性有趨向于正常大鼠的變化。

圖2 熱應激3 h后的加權(A)和非加權(B)分析Fig.2 Weighted(A) and Unweighted(B) analysis charts after 3 hours of heat stress紅色：中藥組； 深藍色：熱應激組； 青色：益生素組； 綠色：常溫空白組；下圖同Red:Traditional Chinese medicine group; Dark blue:Heat stress group; Cyan:Probiotic group; Green:Normal temperature control group. The same as the following figures

圖3 熱應激7 d后的加權(A)和非加權(B)分析圖Fig.3 Weighted(A) and Unweighted(B) analysis after 7 days of heat stress

2.4 物種豐度與群落組成分析 本試驗采用Pynast軟件和Greengenes數(shù)據(jù)庫，比較各試驗組已知序列屬水平相對豐度。如圖4，試驗在熱應激3 h時，益生素組梭菌屬與熱應激組相比顯著降低(P<0.05)，熱應激組梭菌屬也顯著高于常溫空白組(P<0.05)，中藥組顫螺旋菌屬(Oscillospira)均極顯著高于其余3個試驗組(P<0.01)，益生素組的瘤胃球菌屬顯著高于熱應激組(P<0.05)，中藥組的擬桿菌屬也顯著高于常溫空白組(P<0.05)；熱應激1 d時只有4個菌屬顯著變化，其中中藥組乳酸桿菌屬(Lactobacillus)均極顯著高于各試驗組(P<0.01)，益生素組的乳酸桿菌屬也顯著高于熱應激組，中藥組毛螺菌屬含量顯著低于益生素組和熱應激組(P<0.05)；在熱應激3 d時，有15個菌屬有顯著性差異，其中熱應激組與常溫空白組相比乳酸桿菌屬極顯著降低(P<0.01)，中藥組擬桿菌屬(Bacteroides)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)與常溫空白組相比顯著升高(P<0.05)，益生素組顫螺旋菌屬(Oscillospira)也顯著高于常溫空白組；而到了熱應激7 d時，菌屬的差異性變化有18個，隨著熱應激的進行，常溫空白組的擬桿菌屬(Bacteroides)與各試驗組相比均極顯著升高(P<0.01)，與熱應激組相比，各試驗組顫螺旋菌屬和瘤胃球菌屬均極顯著升高(P<0.01)，中藥組糞球菌屬(Coprococcus)顯著高于常溫空白組(P<0.05)，各試驗組毛螺菌屬顯著高于熱應激組(P<0.05)，但中藥組、益生素組和熱應激組3個試驗組的梭菌屬比常溫組的顯著升高(P<0.05)。說明熱應激下腸道微生物的一些優(yōu)勢菌屬發(fā)生了變化，中藥與益生素的治療在熱應激階段對腸道優(yōu)勢菌屬有一定的積極作用。

圖4 各試驗組不同時期腸道菌群屬生物分類水平占比Fig.4 Proportion of intestinal microflora in different periods of each experimental group3 hT、1 dT、3 dT和7 dT:中藥組分別在熱應激3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例； 3 hP、1 dP、3 dP和7 dP:益生素組分別在熱應激3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例； 3 hH、1 dH、3 dH和7 dH:熱應激組分別在熱應激3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例； 3 hC、1 dC、3 dC和7 dC:常溫空白組分別在試驗3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例3 hT,1 dT,3 dT and 7 dT: Proportion of intestinal flora classification of traditional Chinese medicine group at 3 h,1 d,3 d and 7 d of heat stress; 3 hP,1 dP,3 dP and 7 dP: Proportion of intestinal flora classification of probiotic group at 3 h,1 d,3 d and 7 d of heat stress;3 h H,1 dH,3 dH and 7 dH: Proportion of intestinal flora classification of heat stress group at 3 h,1 d,3 d and 7 d of heat stress;3 hC,1 dC,3 dC and 7 dC: Proportion of intestinal flora classification of normal temperature control group at 3 h,1 d,3 d and 7 d

2.5 KEGG群落功能預測注釋 本試驗通過種屬功能基因構成共獲得6 909個與KEGG數(shù)據(jù)庫有顯著配對的功能基因，這些途徑被分為5個主要種類：代謝(Metabolic)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、環(huán)境信息處理(Environment information processing)、細胞過程(Cellular processes)和生物系統(tǒng)(Organismal systems)。5個功能分類，選出35個主要的KEGG途徑，主要的KEGG途徑如圖5所示。各試驗組生物途徑的變化主要集中在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細胞過程這4類生物途徑，其中熱應激組各種生物途徑均比其余3個試驗組活躍，與其他各試驗組相比，熱應激組在糖代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)和膜轉運(Membrane transport)的基因表達活躍，中藥組、益生素組和常溫空白組各生物途徑差異不顯著，且中藥組生物路徑上的基因活動最低，益生素組的生物路徑與常溫空白組接近，說明：(1)熱應激下，機體多個生物功能途徑反應劇烈，以糖代謝、氨基酸代謝和膜轉運最為活躍；(2)熱應激下通過中藥復方口服液和益生素的治療，各生物功能途徑趨于正常，其中益生素組與常溫空白組最接近。

圖5 功能基因的KEGG統(tǒng)計Fig.5 KEGG statistics of functional genes

3 討論

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)被認為是機體受到熱應激之后產生的保護細胞的蛋白質家族，在機體發(fā)生應激的過程中，其他蛋白的合成受到抑制，熱休克蛋白大量合成。熱休克蛋白可分為不同的蛋白分子，其中的HSP70蛋白家族，在溫度變化等應激反應下最具有指導意義。

中醫(yī)的陰陽消長平衡與機體腸道菌群的平衡有著相似之處。在機體的腸道菌群活動也處于這種消長的變化中，腸道菌群出現(xiàn)失調，機體就會發(fā)生疾病[11]。采用16S rDNA 的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術，對熱應激蛋雞小腸段腸道微生物的多樣性和數(shù)量進行檢測，發(fā)現(xiàn)熱應激下腸道微生物菌株豐富，且對乳酸桿菌等優(yōu)勢菌屬有抑制作用[12]。社會混亂(Social disruption,SDR)應激會降低擬桿菌屬的相對豐度，增加梭菌屬的相對豐度[13]。本試驗可得出，大鼠盲腸腸道微生物的多樣性由于處在熱應激環(huán)境而降低，通過灌服中藥復方和益生素，可以使熱應激下腸道菌群物種多樣性恢復至高于正常水平，從而抵御熱應激對腸道的損傷。

通過主成分分析(PCA)和主坐標分析(PCoA)對各試驗組在熱應激3 h和熱應激7 d腸道菌群的組成進行了整體的評價，可以看出熱應激3 h時，中藥組、益生素組和熱應激組的腸道菌群菌落開始出現(xiàn)差異性的趨勢，熱應激7 d后，未經治療的熱應激大鼠腸道菌群多樣性與常溫大鼠相比已有明顯差異，這是由熱應激帶來的損傷引起的，7 d熱應激過程中，一直用中藥復方和益生素治療確實對大鼠盲腸腸道菌群多樣性差異帶來顯著影響，而中藥和益生素產生的積極影響相似。

中藥含有的成分多糖、生物堿、皂甙和黃酮等在腸道菌群轉化為有活性的生物物質，反過來也會影響腸道菌群的生長模式[14-16]。本試驗中，中藥復方在熱應激發(fā)揮的作用，有可能是復方中含有黃芩，黃芩苷通過腸道微生物水解成黃芩素，從而在機體發(fā)揮更重要的生理作用。芳香類藥物的藿香、香薷和陳皮提取揮發(fā)油，其中的藿香揮發(fā)油，可通過抑制細胞因子TNF-Q(腫瘤壞死因子Q)的合成，減少對腸道上皮優(yōu)勢菌群的侵害，從而保護腸上皮細胞的結構組成與功能，達到保護腸屏障功能的作用[17-18]。

本試驗中，熱應激下腸道微生物的一些優(yōu)勢菌屬發(fā)生了變化，乳酸菌屬極顯著減少，梭菌屬增加，中藥組的擬桿菌屬和益生素組的乳酸菌屬顯著升高，說明中藥與益生素的治療在熱應激階段對腸道優(yōu)勢菌屬有一定的積極作用。腸道細菌可以合成參加反應的激素和神經遞質，乳酸桿菌能產生乙酰膽堿和γ-氨基丁酸(GABA)，雙歧桿菌能產生γ-氨基丁酸，鏈球菌和腸球菌能產生血清素，大腸桿菌能產生去甲腎上腺素、血清素和多巴胺，芽孢桿菌能產生去甲腎上腺素和多巴胺[20]。有研究指出，大腸桿菌和變形菌門的大量增加是由于生理濃度的去甲腎上腺素的釋放，是應激反應對感染的直接影響[21]。益生菌和益生素對腸道的保護是通過減少腸道通透性，減少腸道對內毒素的吸收，減少炎性細胞因子的產生。中樞神經系統(tǒng)和神經內分泌活動，特別是應激反應，可能反過來通過改變細菌種類和細菌毒力因子的生長影響腸道微生物群的組成[22]。腸道細菌及其分泌物影響腸神經系統(tǒng)(ENS)的神經興奮，調節(jié)腸道運動和感覺傳入向大腦傳遞信號[23]。KEGG被認為是提供一個系統(tǒng)分析基因功能的基本平臺，從組裝基因進一步預測生化途徑[24]。本試驗得出，熱應激狀態(tài)下，機體通過糖代謝、氨基酸代謝和膜轉運的變化來防御外界應激[25]，從而影響全身從血液到腸道相互作用的變化。